一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工 程领域。
【背景技术】
[0002] 氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单 糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物具有 重要的生理功能，在保健食品和医药领域具有广泛应用，如能特异性地作用于关节软骨，有 效治疗风湿性关节炎；可抑制白血病细胞K562的生长，是新型抗癌药物氯脲霉素的主要成 分；可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用等。
[0003] 氨基葡萄糖和的生产方法可分为三种：甲壳素水解法、生物转化法和微生物发酵 法，其中甲壳素水解是目前生产氨基葡萄糖的主要方法。甲壳素水解是利用强酸强碱将虾 壳或蟹壳中的甲壳素水解，再经过过滤和脱色处理，最后蒸馏结晶得到成品。水解法存在很 多缺点，如原料来源受到一定的地域和季节限制，环境污染严重，部分消费者服用后会过敏 等。生物转化法是指利用微生物的甲壳素水解酶将甲壳素进行酶解得到单体氨基葡萄糖。 相对于水解法，生物转化法对环境的污染较小，但由于甲壳素水解酶的价格较高，目前仅限 于实验室研究阶段。虽然用含有甲壳素水解酶的微生物细胞直接进行生物转化可降低生产 成本，但转化时间很长，生产强度很低。在这种背景下，近几年人们对微生物发酵法生产氨 基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖产生了浓厚的兴趣。相对于水解法和生物转化法，微生物发 酵法具有以下优点：1)发酵时间较短，生产强度较高；2)原料来源不受地域和季节限制，产 品无鱼腥味；3)对环境污染小；4)产品来自微生物，消费者服用后不会出现过敏。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆 菌。
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯 草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，将外源氨基葡萄糖乙酰化 酶编码基因，特别是秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)克隆到表达载体pP43NMK， 然后转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS得到。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因经优化后，核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA_glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作 如下改造 ：八nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ Idh Δ pta: : 1οχ72,并以木糖诱导启动子 PxylA调控表达glmS基因。
[0008] 所述枯草芽抱杆菌BSGN6_PxylA-glmS的构建方法参见：Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production. Yanfeng Liu, et al. Metabolic Engineering, 23(2014)p42-52.
[0009] 本发明优选是用表达载体pP43NMK表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。
[0010] 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建 方法，主要包括如下步骤：
[0011] 1)构建重组质粒
[0012] 将核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（CeGNAl)，连 接到质粒PP43NMK上，得到重组表达载体；
[0013] 2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌
[0014] 将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡 萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
[0015] 本发明还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方 法，将37°C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养基，于 37°C、200rpm条件下发酵30h。
[0016] 重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
[0017] 种子培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10。
[0018] 发酵培养基（g/L):玉米浆干粉 20,酵母粉 20, K2HPO4 · 3H20 12. 5, ΚΗ2Ρ042· 5， CaC035,微量元素 15ml/L ;微量元素溶液按 g/L 计含有=MnSO4 · 5H20 I. 0, CoCl2 · 6Η20 0. 4， NaMoO4 · 2Η20 0· 2, ZnSO4 · 7Η20 0· 2, AlCl3 · 6Η20 0· 1，CuCl2 · H2O 0· 1，H3BO40.0 5,含 5Μ HCl0
[0019] 培养条件：将37°(：、200印111下培养1211的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于 37°C、200rpm条件下培养30h。
[0020] 氨基葡萄糖乙酰化酶属于GCN5相关的GNAT蛋白质超家族，催化N-乙酰葡萄糖 胺-6-磷酸的生成，将乙酰辅酶A中的乙酰基转移到葡萄糖胺-6-磷酸的氨基上，是N-乙 酰氨基葡萄糖合成途径上的关键性酶。对氨基葡萄糖乙酰化酶的改造对在重组枯草芽孢杆 菌积累乙酰氨基葡萄糖有重要作用。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现乙酰氨基葡萄 糖在胞外积累，其浓度在摇瓶水平上可达到7. 31g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌 生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具 有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0021] 乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
[0022] 高效液相色谱（HPLC)检测法=Agilent 1260, RID 检测器，HPX-87H 柱（Bio-Rad Hercules, CA)，流动相：5mM H2SO4，流速 0. 6mL/min，柱温 35°C，进样体积为 10 μ L。
[0023] 实施例1重组质粒的构建
[0024] 根据NCBI上公布的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)中氨基葡萄糖乙 酰化酶编码基因（CeGNAl)核苷酸序列如NCBI GenBank:AB017628.1所示，进行枯草芽孢 杆菌密码子偏好性优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的基于，并由上海生工生物工程 股份有限公司合成基因序列。设计引物CeGNAl-F:5' -GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGT ACACATGAGCCATATCTTCGACGCATCTG-3'，CeGNAl-R :5' -CCCAAGCTTTTAAAAGCGCTGGGTCATAAAAT TA-3'。使用上述引物从合成的序列核苷酸序列SEQ IDNO. 1中扩增优化后的氨基葡萄糖乙 酰化酶编码基因（CeGNAl)。扩增片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载 体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功，命名为pP43-CeGNAl。表达载体pP43NMK的 构建方法参见：High-Level Expression and Secretion ofMethyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800. Xiao-Zhou Zhang, et al.Applied and Environmental Microbiology, 71(4102-4103).
[0025] 实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建
[0026] 将构建好的表达载体pP43-CeGNAl转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS。采 用CeGNAl-F及CeGNAl-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现498bp条带，验证重组枯草芽 孢杆菌构建成功。
[0027] 实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
[0028] 将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37°C、 200rpm条件下培养30h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到7. 31g/L。对 照菌株以BSGN6-PxylA_glmS为出发菌株，过量表达来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因 GNAl (核苷酸序列如NCBI GenBank: NM_001179949)，相同培养条件下最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到 5. 87g/L。通过比较，表达了秀丽隐杆线虫来源的CeGNAl基因的重组枯草芽孢杆菌发酵上 清液中乙酰氨基葡萄糖产量较表达了酿酒酵母来源GNAl基因的对照菌株提高了 24. 51%。 通过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（CeGNAl)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽 孢杆菌胞外的积累。
[0029] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，表达了外源氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因CeGNAl。2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：（1)AnagPA gamPAgamAAnagAAnagBAIdhApta::lox72，（2)以木糖诱导启动子PxylA调控表达氨 基葡萄糖合成酶基因glmS。3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，氨基葡萄糖乙酰化酶编码 基因为秀丽隐杆线虫来源，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。4. 权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以PP43NMK为表达载体表达氨基 葡萄糖乙酰化酶编码基因。5. -种构建权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下 步骤： 1) 构建重组质粒 将核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因连接到载体PP43NMK得到重组表达载体； 2) 构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌 将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡萄糖 的重组枯草芽孢杆菌。6. 应用权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其 特征在于，将37°C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养 基，于37°C、200rpm条件下发酵30h。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按每L计含有：玉米浆干 粉 20g，酵母粉 20g，K2HPO4 ? 3H20 12. 5g，KH2P042. 5g，CaC035g，微量元素溶液 15ml;微量元 素溶液按g/L计含有：MnS04 ? 5H20I. 0,CoCl2 ? 6H20 0? 4,NaMoO4 ? 2H20 0? 2,ZnSO4 ? 7H20 0? 2,AlCl3 ? 6H20 0? 1，CuCl2 ?H2O0? 1，H3BO4O. 05,含 5MHC1。
【专利摘要】本发明公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS作为出发菌株，通过过量表达来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis？elegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)，加强氨糖合成途径，得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，摇瓶水平上产量达到7.31g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/75, C12N1/21, C12R1/125, C12P19/26
【公开号】CN105176903
【申请号】
【发明人】刘龙, 陈坚, 堵国成, 李江华, 徐小芳, 刘延峰, 马文龙
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日