一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球的制备方法，属于乳糖酶领域。
【背景技术】
[0002]低乳糖饮用乳中的乳糖进入小肠后，由于乳糖酶的缺乏，乳糖不能被分解成葡萄糖和半乳糖被吸收，称为乳糖消化不良和乳糖吸收不良。当乳糖进入结肠后，被细菌发酵生成短链有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等和气体如甲烷、H2、C02等，乳糖发酵过程可引起肠鸣、腹痛、直肠气体和渗透性腹泻，存在这些症状时称为乳糖不耐受症，严重的乳糖消化不良或吸收不良多在摄入一定量乳糖后30分钟至数小时内发生。乳糖酶缺乏者中有20%左右的人存在乳糖不耐受症状，而且乳糖不耐症状个体差异很大。不耐受症状的多少和严重程度与小肠内乳糖酶活性、摄入的乳糖量以及是否同时摄入其它类食品有关。
[0003]—般水解70%?80%的乳糖即可解决乳糖不耐症的问题。目前，降低乳糖的方法有三种:超滤法、化学酸水解法和酶解法，其中酶解法最适合生产低乳糖牛奶。用半乳糖昔酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，可以有效地消除人体对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业，提高人民的健康水平具有十分重要的意义。但是，将半乳糖普酶直接加入牛乳中，酶的活性较低、半衰期短，酶只能使用一次，利用率低，导致生产成本较高，限制了
半乳糖昔酶在乳制品工业中的应用不能适应日益增长的市场需求。为克服这些问题，可通过物理的或化学的方法，将乳糖酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，并可以重复使用，即固定化乳糖酶。作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性质对固定化酶的各种性能都有着巨大的影响。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前将半乳糖普酶直接加入牛乳中，酶的活性较低、半衰期短，酶只能使用一次，利用率低，导致生产成本较高，限制了半乳糖昔酶在乳制品工业中的应用的问题，提供了一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球的制备方法，本发明以氯化亚铁、氯化铁、氨水为主要原料，采用化学共沉淀法合成了氧化铁微粒，再和壳聚糖一起制成磁性壳聚糖微球，向磁性壳聚糖微球中加入乳糖酶溶液进行交联反应，用磁性使壳聚糖微球将乳糖酶固定，生产出低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球，本发明用磁性壳聚糖微球作为
载体固定化乳糖酶，使乳糖酶保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，方便重复使用，而且其贮存稳定性好。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(I)按摩尔比为9:5称取质量分数15%氯化铁和质量分数25%硫酸亚铁混合溶液倒入带有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，之后用注射器将质量浓度为30%的氨水逐滴滴入三口烧瓶中，调节pH至10?12，移入水浴锅升温至40?50°C，放置在磁力搅拌机上以600?700r/min的转速搅拌20?30min，继续升温至70?80°C，保温陈化I?2h ;
(2)将陈化后的混合物移入卧式离心机，以8000?9000r/min的转速高速离心处理10?15min，分离得到沉淀物，将沉淀物用去离子水冲洗多次直至pH为7?8，得氧化铁微粒；
(3)称取5?1g壳聚糖溶于200?300mL质量浓度为10%的乙酸溶液中，用玻璃棒搅拌均匀使壳聚糖完全溶解，再加入10?20g上述制得的氧化铁微粒，放入超声振荡仪超声振荡混合10?20min ；
(4)在带有搅拌器和加热装置的三口烧瓶中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入80?90mL石錯油、7?8mL聚山梨酯-80和0.3?0.5g硬脂酸镁，升温至40?50 °C，启动搅拌器以200?300r/min的转速搅拌，并在搅拌过程中滴加3?5mL聚乙二醇，保持转速搅拌反应I?2h，再用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH至10?12，升温至60?70°C，继续反应2?3h，过滤后得到沉淀物，用去离子水冲洗3?5次，得到磁性壳聚糖微球；
(5)取500?600mg上述制得的磁性壳聚糖微球加入到250mL的三角瓶中，倒入50?10mL磷酸缓冲溶液充分溶胀12?18h，之后加入质量浓度为80%的乳糖酶溶液，放入冰水浴，在4?6 °C下充分吸附I?2h，再加入质量浓度为40%的戊二醛溶液，升温至30?40°C，保温40?60min发生交联反应；
(6)在上述发生交联反应的三角瓶底部均匀放置磁铁，将瓶中磁性微球沉淀下来，倾倒去除上清液，收集沉淀物并用磷酸缓冲液冲洗3?5次后移入烘箱，在50?60 °C下干燥2?3h，即得一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球。
[0006]本发明的应用方法:本发明制得的固化酶可以添加到乳糖饮用乳品中进行降解乳糖，将固定化酶和液体酶置于4°C冰箱保存，分别于一定时间取出测其酶活力，乳糖酶被固定化后，其贮存稳定性有所提高，放置30天后，固定化酶的相对酶活力仍能达到60?65%，而液体酶的相对酶活力则下降至28?30%。
[0007]本发明的有益效果是:
(1)本发明用磁性壳聚糖微球作为载体固定化乳糖酶，使乳糖酶保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，方便重复使用，而且其贮存稳定性好；
(2)本发明利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。
【具体实施方式】
[0008]首先按摩尔比为9:5称取质量分数15%氯化铁和质量分数25%硫酸亚铁混合溶液倒入带有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，之后用注射器将质量浓度为30%的氨水逐滴滴入三口烧瓶中，调节pH至10?12，移入水浴锅升温至40?50°C，放置在磁力搅拌机上以600?700r/min的转速搅拌20?30min，继续升温至70?80°C，保温陈化I?2h ;将陈化后的混合物移入卧式离心机，以8000?9000r/min的转速高速离心处理10?15min，分离得到沉淀物，将沉淀物用去离子水冲洗多次直至pH为7?8，得氧化铁微粒；称取5?1g壳聚糖溶于200?300mL质量浓度为10%的乙酸溶液中，用玻璃棒搅拌均匀使壳聚糖完全溶解，再加入10?20g上述制得的氧化铁微粒，放入超声振荡仪超声振荡混合10?20min ；在带有搅拌器和加热装置的三口烧瓶中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入加入80?90mL石蜡油、7?8mL聚山梨酯-80和0.3?0.5g硬脂酸镁，升温至40?50°C，启动搅拌器以200?300r/min的转速搅拌，并在搅拌过程中滴加3?5mL聚乙二醇，保持转速搅拌反应I?2h，再用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH至10?12，升温至60?70°C，继续反应2?3h，过滤后得到沉淀物，用去离子水冲洗3?5次，得到磁性壳聚糖微球；取500?600mg上述制得的磁性壳聚糖微球加入到250mL的三角瓶中，倒入50?10mL磷酸缓冲溶液充分溶胀12?18h，之后加入质量浓度为80%的乳糖酶溶液，放入冰水浴，在4?6°C下充分吸附I?2h，再加入质量浓度为40%的戊二醛溶液，升温至30?40°C，保温40?60min发生交联反应；在发生交联反应的三角瓶底部均匀放置磁铁，将瓶中磁性微球沉淀下来，倾倒去除上清液，收集沉淀物并用磷酸缓冲液冲洗3?5次后移入烘箱，在50?60°C下干燥2?3h，即得一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球。
[0009]实例I
首先按摩尔比为9:5称取质量分数15%氯化铁和质量分数25%硫酸亚铁混合溶液倒入带有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，之后用注射器将质量浓度为30%的氨水逐滴滴入三口烧瓶中，调节pH至10，移入水浴锅升温至40°C，放置在磁力搅拌机上以600r/min的转速搅拌20min，继续升温至70°C，保温陈化Ih ;将陈化后的混合物移入卧式离心机，以SOOOr/min的转速高速离心处理10?15min，分离得到沉淀物，将沉淀物用去离子水冲洗多次直至PH为7，得氧化铁微粒；称取5g壳聚糖溶于200mL质量浓度为10%的乙酸溶液中，用玻璃棒搅拌均匀使壳聚糖完全溶解，再加入1g上述制得的氧化铁微粒，放入超声振荡仪超声振荡混合1min ;在带有搅拌器和加热装置的三口烧瓶中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入上述超声混合后的溶液，再向其中加入加入SOmL石蜡油、7mL聚山梨酯-80和0.3g硬脂酸镁，升温至40 °C，启动搅拌器以200r/min的转速搅拌，