一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纤维素降解技术领域，尤其涉及一种纤维素降解方法、其工艺参数的 优化方法及其纤维素降解酶筛选方法。
【背景技术】
[0002] 海南盛产椰子，大量椰壳废弃，不仅污染环境，而且造成能源浪费。椰壳内含有 68%的纤维素，完全降解为葡萄糖后经酵母菌发酵为生物乙醇，可以实现资源的有效利用。
[0003] 但现有纤维素降解工艺中主要存在以下的一些问题。例如，纤维素分子链牢牢连 在一起，形成高结晶结构，不溶于水，具有抗解聚能力。与纤维素结合在一起的木质素对纤 维素降解成葡萄糖也会形成物理屏障，木质素会不可逆无效地吸收纤维素酶，导致纤维素 水解率较低。工业化规模生产高活性纤维素酶尚未能有效实现。上述这些问题使得木质纤 维素酶解效率（即糖化率）较低，无法有效的实现大规模工业生产。
[0004] 另外，由于化学预处理法能有效降低纤维素的结晶度，除去半纤维素或木质素，具 备能耗低、周期短、效率高、条件较温和等优点。所以，在工业化应用中通常会采用酸/碱法 预处理等预处理方法来降低纤维素的结晶度，除去木质素，从而实现更好的纤维素降解效 果。但现有研究多针对某一具体方面或者反应机理的研究，尚未有对不同化学预处理方法 进行系统分析、全面评价的研究成果。
[0005] 因此，现有技术还有待发展。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种纤维素降解方法、其 工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法，旨在解决现有技术在纤维素降解工业化 生产中酶解效率较低的问题。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
[0008] -种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料 各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方 法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平 设计多组预处理实验条件；分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处 理；对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并测定计算木质纤维素原料的糖化率。
[0009] 所述的优化方法，其中，采用NREL法测定木质纤维素原料各组分的含量；采用葡 萄糖试剂盒测定法测定计算所述木质纤维素原料的糖化率。
[0010] 所述的优化方法，其中，所述依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条 件包括：采用正交实验设计方法，设计碱法处理的若干组预处理实验条件。
[0011] 所述的优化方法，其中，所述正交实验设计使用L16(44)正交表，具体包括反应时 间、反应温度、纤维素降解酶用量以及碱的用量四个实验因素；每个实验因素均设置四个水 平。
[0012] -种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料 各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方 法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平 设计多组预处理实验条件；对木质纤维素原料依据所述预处理实验条件进行预处理；对预 处理后的木质纤维素原料进行酶解并且利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化 率。
[0013] 所述利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率的步骤具体包括：确定葡 萄糖的Rf值；通过苯酚硫酸法绘制葡萄糖标准曲线并计算曲线方程；测定某一预处理实验 条件的木质纤维素原料酶解后的葡萄糖含量；计算木质纤维素原料的糖化率。
[0014] 所述的一种优化方法，其中，所述薄层层析的展开剂pH值为5. 0。
[0015] -种使用如上所述的优化方法获得的纤维素降解方法，其中，包括如下步骤：使用 〇. 15mg的氢氧化钠，在80°C的条件下对木质纤维素原料进行预处理；将预处理后的木质纤 维素原料使用I. 5ml的纤维素降解酶进行处理。
[0016] -种筛选如上所述的纤维素降解菌的方法，其中，包括如下步骤：采集红棕象甲幼 虫样品并制备红棕象甲幼虫的菌悬液；选择使用CMC-Na作为培养基的唯一碳源，KN03作为 培养基的唯一氮源来富集培养所述菌悬液中的纤维素降解菌；筛选并初步鉴定所述纤维素 降解菌；分离纯化已初步鉴定的纤维素降解菌；对分离纯化后的纤维素降解菌进行酶活力 测定。
[0017] 所述的筛选方法，其中，筛选所述纤维素降解菌的具体步骤包括：将富集培养后获 得的菌液进行梯度稀释；稀释后菌液涂布于培养基中培养；培养长出菌落后，再将菌落转 接到初筛培养基上，通过刚果红染色法对初筛培养基进行染色并观察菌落透明圈情况。
[0018] 有益效果：本发明提供的一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维 素降解酶筛选方法。结合多种不同的化学预处理方法，合理的设置实验条件，从而完成对纤 维素降解工艺参数的整体考量，揭示了各影响因素之间的相互作用关系，有效的实现了工 艺参数的优化。并且进一步的提供了一种筛选高效降解纤维素的菌种的方法，同时对预处 理和后续酶解操作两个步骤的效率优化均进行了改进，从而进一步的大幅提升纤维素酶解 的效率。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明具体实施例的纤维素降解工艺参数的优化方法的方法流程图。
[0020] 图2为本发明具体实施例的纤维素降解方法的方法流程图
[0021] 图3为本发明具体实施例的纤维素降解菌的筛选方法的方法流程图
[0022] 图4为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解真菌的示意图。
[0023] 图5为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解真菌的透明圈示意图。
[0024] 图6为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解细菌的透明圈示意图。
[0025] 图7为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解另一细菌的透明圈示意图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选 方法。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本 发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0027] 如图1所示为本发明的纤维素降解工艺参数的优化方法的具体实施例。
[0028] 所述优化方法包括如下步骤：
[0029] Sl、测定木质纤维素原料各组分的含量。
[0030] 在以木质纤维素进行酶解的过程中，纤维素、半纤维素的含量多少与总糖得率直 接相关。三组分（纤维素、半纤维素以及木质素）的含量变化更是评价预处理、酶解及发酵 工艺条件的重要依据。因此需要首先测定木质纤维素原料各组分的含量。
[0031] 在本发明一具体实施例中，可以采用NREL法进行测定。这一方法是由美国国家可 再生能源实验室（NREL)提供的系统测定木质纤维素原料中三组分含量的方法，操作简单 而且可进行大批量同时测定，已经被广泛应用，为本技术领域人员所熟知，在此不作赘述。
[0032] S2、分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法 设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平。
[0033] 在现有的化学预处理方法中，通常均采用碱或者酸处理，并未对两者的处理效果 进行比较。采用上述方式，能够系统的比较不同预处理工艺的效果，从而实现整体的优化及 考虑。
[0034] S3、依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件（即多个实验组）。具体 可以采用多种合适的实验设计方法完成上述步骤。例如，可以采用正交实验设计的方法设 置实验组。当然，还可以使用其他统计学模型设置。
[0035] S4、分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理。
[0036] S5、对预处理后的木质纤维素原料进行酶解。
[0037] S6、测定计算木质纤维素原料的糖化率。所述木质纤维素原料的糖化率可以通过 现有合适的测定葡萄糖浓度的方法来测定并经过计算获得。例如，可以使用商业化的葡萄 糖试剂盒来进行测定。
[0038] 在获得不同实验组的糖化率后（亦即实验结果），通过相应的计算来获得木质纤 维素的最优处理工艺参数。具体计算方式可以依据步骤S3中具体采用的实验设计方法所 确定。如采用正交实验设计时，则使用相对应的正交分析表。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例为采用酸法预处理的木质纤维素降解工艺参数的优化方法。
[0041] 一、制作木质纤维素原料（去除油脂成分的原料椰壳粉）：取废弃椰壳，先切成小 块，在中药粉碎机下，打成粉末，烘干，称重。然后，将上述干燥椰壳粉加入圆底烧瓶中，加入 适量无水乙醇于95°C水浴中索式抽提完全，风干，得到原料椰壳粉，称重。
[0042] 二、NREL法测定木质纤维素原料：
[0043] 浓酸的处理：取三支干燥试管，分别加入0. 5g、I. 0g、2. Og的原料椰壳粉，再分别 加入72%的硫酸3ml、6ml、12ml，摇匀，30°C水浴60min。将上述浓酸的水解液转移至锥形 瓶中，并稀释酸的浓度至4%，所加蒸馏水包括冲洗水在内分别是51ml、102ml、204ml，将其 放置在立体式压力蒸汽灭菌器，于121°C保温45min。取出三支试管，过滤，滤液用NaOH溶 液调节pH至2，滤渣用蒸馏水洗涤至中性，再烘干，称重。
[0044] 三、预处理工艺参数的优化实验设计：
[0045] 取98%的浓硫酸。根据公式98/X = A(即lml98%的硫酸可配Aml浓度为X%，那 么加蒸馏水（A-l)ml)配置出其他所需不同浓度的硫酸。
[0046] (1)不同的酸浓度预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编 号0.5%、1%、2%、3%、4%，再加入对应浓度的硫酸，在70 °C HH-S型水浴锅中反应60min。
[0047] (2)不同的反应时间预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别 编号