一种通过二次发酵提升菌丝体废渣几丁质含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]几丁质，又称甲壳素或聚乙酰氨基葡萄糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。在甲壳类动物、昆虫的外壳以及真菌的细胞壁中广泛存在，也存在于一些绿藻中；主要是用来作为支撑身体骨架，以及对身体起保护作用。在工业上甲壳素是提取壳聚糖、氨基葡萄糖系列产品的重要原料，甲壳素及其衍生物在医药、化工、保健食品等方面具有重要用途，可用于制备可溶性甲壳质和氨基葡萄糖，可用作化妆品和功能性食品的添加剂，可制备照相感光乳剂等；同时，几丁质具有强吸湿性，亦具有良好的保湿效果，并且具有吸附重金属离子的功能，在生产上具有广阔的应用前景。
[0003]传统的几丁质提取主要从虾蟹壳中获得，但面临诸多问题:虾蟹产量不稳定；原料难以保鲜；来源多样、差异较大，品质无法保障；采用化学提取对环境污染严重。而从真菌细胞壁中提取几丁质则不受以上限制，可进行规模化生产。然而，如直接培养真菌菌丝体，则存在设备要求高、培养基和培养条件需严格控制、投入成本过大等问题，使几丁质制备工艺的经济性受到挑战。我国是柠檬酸生产大国，而黑曲霉是工业生产柠檬酸的常用菌种，采用黑曲霉进行柠檬酸发酵的工艺中，会产生大量菌丝体废渣，这为从黑曲霉菌丝体提取甲壳素提供了可能性。而且工艺过程成本低廉，同时为综合利用发酵废渣资源提供了一条新思路。然而，目前柠檬酸发酵生产中所残余的黑曲霉菌丝体废渣几丁质含量低于3%，这造成了产物收率低、生产成本高等不足，限制了黑曲霉作为几丁质提取原料的广泛应用。木霉具有生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出等特点，采用木霉属菌株进行菌丝体废渣的固态发酵，可有效提高废渣中的几丁质含量；由于柠檬酸发酵过程中采用20%玉米淀粉为碳源，工艺中玉米淀粉无法充分利用，因此废渣主要由菌丝体、玉米淀粉以及其他金属盐所组成。玉米淀粉的存在满足了二次发酵所需碳源和无机盐，如能进一步补充适量氮源将能使木霉能在该固体培养基中良好生长、同时通过自身菌体的富集又能增加细胞壁几丁质含量，从而极大的提高了从菌丝体提取几丁质的产量。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种利用木霉属菌株二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量的方法。本发明所述的提升菌丝体废渣中几丁质含量的方法如下:
1、菌丝体废渣的前处理:收集柠檬酸发酵后的含玉米淀粉渣的黑曲霉菌渣，补充0.1%-1%蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵或尿素等作为氮源，混合均匀，在115-125°c灭菌15—30 min以去除杂困，备用；
2、种子制备:木霉菌种为常规的工业用菌种，包括里氏木霉(;「ricAoofe/TKsreesei)^深绿木 ^ ( Trichoderma aureoviride)、哈茨木 ^ ( Trichoderma harziamum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、康宁木霉(Trichoderma等生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出的木霉菌株。种子培养基为麸皮20-100 g/L，玉米粉10-50 g/L，硫酸铵1-5 g/L，KH2PO4 2-6 g/L，吐温-800.5-2.5 g/L ο将种子培养基在115-125°C灭菌15-30 min，待冷却后接种木霉菌种，接种量为10%-50%，接种的孢子悬液浓度为15-1O9个孢子/mL，于25_35°C，120-250 rpm摇床上振荡培养24-48 h，制备获得种子液。
[0005]3、固态发酵:以灭过菌的黑曲霉菌丝体废渣及蛋白胨培养基为支持物，将培养好的种子液按照10%-50%的接种量接种至废渣中，搅拌均匀，于25-35°C，静置发酵培养2_7d，即获得二次发酵的菌丝体废渣。此时的废渣中几丁质含量相比初始水平有明显提升，提高幅度为2%-5%，即几丁质最终含量约为5%-8%，可用于下游提取。
[0006]4、几丁质提取:收集二次发酵的菌丝体，其中包括黑曲霉及木霉菌丝体，将两种原料进行电解，电泳仪的电压控制在6-30 V，电流设置为10-200 mA，并在反应液中加入1_5%的NaOH溶液，反应时间为4-25 h，将电解后的固体物质洗涤并干燥。即制备获得几丁质。
[0007]【【具体实施方式】】
由本发明技术方案所生产的几丁质，具有产量高、环境友好等特点，而且使柠檬酸发酵废弃残渣得以有效利用，提高了资源综合利用价值，降低了几丁质的生产成本，减少了环境污染，有利于环境保护。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施情况，目的在于帮助读者更好的理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0008]实施例1利用里氏木霉二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量:
收集柠檬酸发酵后的含玉米淀粉的黑曲霉菌渣，补充0.1%蛋白胨作为氮源，混合均勾，在115°C灭菌15 min ;采用里氏木霉(7—ricAoofe/TKs reesei)作为发酵菌种。首先进行种子液的制备，种子培养基组分为麸皮20 g/L，玉米粉10 g/L，硫酸铵lg/L，KH2PO4 2 g/L，吐温-80 0.5 g/L ο将种子培养基在115°C灭菌15 min，待冷却后接种木霉菌种，接种量为10%%，接种的孢子悬液浓度为15个孢子/mL，于25°C，120 rpm摇床上振荡培养24 h，制备获得种子液。以灭过菌的黑曲霉菌丝体废渣及蛋白胨培养基为支持物，将培养好的种子液按照10%的接种量接种至废渣中，搅拌均匀，于25°C，静置发酵培养3 d，即获得二次发酵的菌丝体废渣。此时的废渣中几丁质含量相比初始水平提高约2%，即几丁质最终含量5%。
[0009]
实施例2利用长枝木霉二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量:
收集柠檬酸发酵后的含玉米淀粉的黑曲霉菌渣，补充0.5%蛋白胨作为氮源，混合均勾，在115°C灭菌20 min以去除杂菌，选取长枝木霉(7—ricAoofe/Tas longibrachiatum)W%二次发酵菌种，该菌株生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出。首先进行种子培养，种子培养基为麸皮30 g/L，玉米粉35 g/L，硫酸铵5 g/L, KH2PO4 2 g/L，吐温-80 2.5 g/L。将种子培养基在115°C灭菌20 min，待冷却后接种木霉菌种，接种量为30%，接种的孢子悬液浓度为19个孢子/mL，于30°C，150 rpm摇床上振荡培养48 h，制备获得种子液。以灭过菌的黑曲霉菌丝体废渣及蛋白胨培养基为支持物，将培养好的种子液按照30%的接种量接种至废渣中，搅拌均匀，于30°C，静置发酵培养7 d，即获得二次发酵的菌丝体废渣。此时的废渣中几丁质含量相比初始提升约5%，即几丁质最终含量约为8%。
[0010]
实施例3利用康宁木霉二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量: 收集柠檬酸发酵后的含玉米淀粉的黑曲霉菌渣，补充0.5%蛋白胨作为氮源，混合均勾，在121°C灭菌20 min以去除杂菌，选取康宁木霉(7—ricAoofe/Tas作为二次发酵菌种，该菌株生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出。首先进行种子培养，种子培养基为麸皮 30 g/L，玉米粉 20 g/L，硫酸铵 1.5 g/L, KH2PO4 2.3 g/L，吐温-80 2 g/L。将种子培养基在121°C灭菌20 min，待冷却后接种木霉菌种，接种量为20%，接种的孢子悬液浓度为18个孢子/mL，于28°C，150 rpm摇床上振荡培养48 h，制备获得种子液。以灭过菌的黑曲霉菌丝体废渣及蛋白胨培养基为支持物，将培养好的种子液按照20%的接种量接种至废渣中，搅拌均匀，于28°C，静置发酵培养5 d，即获得二次发酵的菌丝体废渣。此时的废渣中几丁质含量相比初始提升约3.5%，即几丁质最终含量约为6.5%。
【主权项】
1.利用木霉属菌种二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量的方法，其特征在于，采用生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出的木霉作为发酵菌种，以工业柠檬酸发酵中废弃玉米菌丝体废渣为主要原料，进行固态发酵，提升柠檬酸发酵所残留的废弃菌丝体中几丁质含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所采用的玉米菌丝体废渣需进行前处理，方法为添加0.1%_1%的氮源，所用氮源选自硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉或尿素中的至少一种，混合均勾，在115_125°C灭菌15-30 min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用木霉属菌种，选自里氏木l^iTrichodenna reesei)^ 深绿木 l^iTrichodenna aureoviride)^ 哈茨木霉(Trichoderma harziamum)、绿色木霉(Trichoderma viride)^ 长枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum')、氤今太屬X Trichoderma koningii')中的至少一种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所采用的木霉菌种发酵周期为2-7d，即可获得几丁质含量提升的二次发酵菌丝体废渣。5.利用木霉属菌种二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量的方法，其菌丝体废渣还适用于工厂化食用菌栽培的副产物菌根、菌渣，适用于以黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、酵母为菌种的发酵废渣。
【专利摘要】本发明涉及一种利用木霉属菌种二次发酵提升菌丝体废渣中几丁质含量的方法。采用生长旺盛、代谢能力强、产纤维素酶能力突出的木霉菌种，以工业柠檬酸发酵中废弃玉米菌丝体废渣为基本培养基，并在其中添加适量硫酸铵等氮源，进行二次固态发酵，提升菌丝体废渣中的几丁质含量，本发明技术方案不仅为大宗发酵产品柠檬酸发酵菌丝体废渣的资源化利用提供了一条新途径，而且为重要工业原料几丁质的生物法生产提供了新的思路。该方法所得几丁质产品生产成本低、产量高、环境友好，而且使柠檬酸发酵废弃残渣得以有效利用，提高了资源综合利用价值，减少了环境污染，有利于环境保护。
【IPC分类】C12P19/26, C12R1/885
【公开号】CN105177089
【申请号】
【发明人】史劲松, 龚劲松
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月10日