中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒的制作方法

文档序号:8959643阅读:269来源:国知局
中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及检测用试剂盒。
【背景技术】
[0002] 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,是我国特有的水产养殖珍品,但随 着养殖集约化和规模化发展,各种病害已经成为危害养蟹业的重要难题。近几年,在江苏省 兴化市、盐城市盐都区和泗洪县等地的河蟹主养区广泛流行微孢子病,该疫情给当地的河 蟹养殖产业造成了巨大损失。主要症状为河蟹附肢长期空瘪,虽能继续蜕壳,但生长缓慢, 解剖见肝胰脏颜色由金黄色逐渐变浅,直至灰白色,部分还出现"拉黄"(排泄肝胰腺)的症 状。至今为止,关于该病的诊断仍然是主要采用解剖观察的方法,具有明显的局限性,因此 开发出更加高效、准确和便捷的诊断方法将有非常显著的现实意义和广阔的应用前景。
[0003] 原位杂交技术是利用带有标记物的特征性核酸序列作为探针,与样品中互补的核 酸序列杂交,然后通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应将检测信号逐级扩大,显 示检测结果。原位杂交假阳性率低,从直观性、准确性和灵敏度综合考虑是一种其它任何方 法都无法替代的检测方法,且至今未见有关中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测方法的报 道。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于高灵敏度、高可信度同时又非常直观的中华绒螯 蟹微孢子虫检测的探针,并提供检测试剂盒。
[0005] 本发明根据中华绒螯蟹微孢子虫18S SSU rDNA(HE584635)设计一对特异性引物, PCR扩增,以地高辛进行标记,制备特异性检测中华绒螯蟹微孢子虫的探针,所述探针如SEQ ID NO. 1所示,该探针的引物序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0006] 本发明公开了中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针,序列如SEQ ID NO. 1所 示。该序列以地高辛进行标记可制备成检测中华绒螯蟹微孢子虫的特异性探针,用于检测 试剂盒中。
[0007] 本发明还公开了 SEQ ID NO. 1所示序列作为中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测 探针的应用。
[0008] 本发明公开了上述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针在制备中华绒螯蟹 微孢子虫的原位杂交检测试剂盒中的应用。
[0009] 此外,本发明还提供一种用于中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测试剂盒,该试 剂盒包括原位杂交检测试剂,还含有由上述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针制备 的特异性探针。具体地,该试剂盒由多个试剂瓶组成,所述的试剂瓶包括含特异性探针A液 (探针浓度100 μ g/ml),所述特异性探针是指经地高辛进行标记的SEQ ID NO. 1,含蛋白酶 K (10 μ g/ml)的B液,用于促进探针结合的C液(Dig Easy Hyb Granules, Roche),封闭非 特异性蛋白位点的D液(10X ,Blocking solution,Roche),含有碱性磷酸酶标记地高辛抗 体的E液,用于显色的F液(50XNBT/BCIP)。
[0010] 本发明具有如下有益效果:
[0011] (1)能直观地将微孢子虫与其引起的病理变化结合起来;
[0012] (2)在高效、准确检测微孢子虫的同时可根据样本切片分析感染率和感染强度;
[0013] (3)由于探针的杂交是特异的,且信号经过了逐级放大,所以较常规的染色检测灵 敏、精确;
[0014] (4)本发明中,显色后的切片可以长期保存。
【附图说明】
[0015] 图1,健康中华绒螯蟹阴性对照;
[0016] 图2,轻度微孢子虫感染的中华绒螯蟹原位杂交检测结果;
[0017] 图3,重度微孢子虫感染的中华绒螯蟹原位杂交检测结果。
[0018] 图中标尺=100μηι。
【具体实施方式】
[0019] 下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明,不应该当作对本发明的限制。以 下实施例中除特别说明外,均为本领域内的常规试剂、实验方法和操作步骤。
[0020] 实施例1 :
[0021] 中华绒螯蟹样品:
[0022] 发病中华绒螯蟹于2014年8月取自江苏省内发生严重死亡的养殖场,平均重量 91. 2g(样本量η = 30)。健康中华绒螯蟹于2014年9月,取自南京中华绒螯蟹养殖场,平 均重量94. 3g(样本量η = 24)。健康中华绒螯蟹通过常规光镜、电镜观察和PCR检测,确定 无微孢子虫感染,作为阴性对照;发病中华绒螯蟹经光镜、电镜观察和PCR检测确定是有微 孢子虫感染后,作为阳性对照。
[0023] 样品固定及切片制备:
[0024] (1)固定:取中华绒螯蟹易感染组织肝胰腺于含0.1%DEPC的4%多聚甲 醛(1000ml蒸馏水中加 Na2HPO4. 12H20 36g,多聚甲醛干粉40g,加热搅拌溶解后加 NaH2PO4. 2H20 3g,pH 7. 0 ;趁热加 DEPC至终浓度0· 1 % )固定2小时后,用PBS洗涤3次, 每次30min,然后脱水、透明、石蜡包埋、切片;
[0025] (2)切片(需同时做阳性和阴性对照):将组织切成厚度为7-10 μm的组织切片, 并将烘烤后的切片保存于4°C冰箱。
[0026] 探针合成:
[0027] (1)收集微孢子虫感染的中华绒螯蟹肝胰腺,利用基因组DNA提取试剂盒 (QIAGEN,51304)进行模板DNA的提取,具体步骤参照试剂盒的说明书。
[0028] (2)用于合成探针的DNA片段是根据⑴中提取的模板,由下面一对引物扩增出来 的,引物序列如下:
[0029] W3F :5'-CTGTGAGGCTATTGTTGGGC-3'(SEQ ID NO. 2)
[0030] W3R :5,-TACTGTGCTCCCTGTCCATT-3'(SEQ ID NO. 3)
[0031] 按照以下步骤将上述引物扩增出的目的片段(序列信息如SEQ ID NO. 1所示)经 过胶回收后用地高辛标记过夜即为检测中华绒螯蟹微孢子虫的特异性核苷酸探针:
[0032] 具体制备方法为:
[0033] (I)PCR反应体系如下表:
[0035] (2) PCR扩增程序如下:首先95 °C变性4min ;紧接着40个循环的95 °C Imin, 58°C 30s,72°C Imin ;最后是 72°C延伸 5min,4°C保存。
[0036] (3)探针标记步骤如下:1 %琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收DNA,Nanodrop 2000紫外分光光度计对浓度进行定量,取I μ g凝胶回收的DNA加入无菌蒸馏水,至总体积 16 μ 1,煮沸变性IOmin后立刻置于冰上,加入4 μ I DNA地高辛标记液,37°C孵育24h,最后 加入2μ1 0. 2M EDTA(pH 8. 5)终止反应,该产物即为标记好的探针,-20°C保存。
[0037] 原位杂交检测:
[0038] 将上述特异性探针与制备好的切片进行原位杂交,所述的特异性探针与样本目的 片段结合,并进一步结合碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段,通过碱性磷酸酶显色系统 进行信号放大检测。本发明提供的试剂盒由多种试剂组成,包括用于含特异性探针的A液 (探针浓度100 μ g/ml),含蛋白酶Κ(10 μ g/ml)的B液,用于促进探针结合的C液(Dig Easy Hyb Granules, Roche),封闭非特异性蛋白位点的 D 液(10X ,Blocking solution,Roche), 含有碱性磷酸酶标记地高辛抗体的E液,用于显色的F液(50XNBT/BCIP)。
[0039] 具体如下:
[0040] (1)将组织切片进行脱蜡:二甲苯5minX2,二甲苯+无水乙醇(I :l)5min ;
[0041] (2)酒精梯度清洗:无水乙醇101^1^2,95%、90%、80%、70%的乙醇各511^11,最 后 PBS IOmin ;
[0042] (3)Triton X-10010min,PBS 10min,37 cC 下 B 液(蛋白酶 K 50μg/ml)清 洗1511^11,0.2%甘氨酸511^11,?85(似(:188,1((:10.28,似 2册04 1.448,腿2?04 0 . 248,用 DEPC-H2O配置1L,调整pH为7. 4)5minX2,4%多聚甲醛滴片固定5min ;
[0043] (4)PBS 5minX 2,再将切片放入55°C去离子甲酰胺和IX柠檬酸三钠 -NaCl缓冲 液(SSC,1000ml蒸馏水中加氯化钠8. 8g,柠檬酸三钠 4. 4g)的等量混合液中浸泡30min ;
[0044] (5)预杂交:在干的杂交盒底部加20 %甘油20ml以保持湿度,按每张20 μ 1加 A 液,恒温箱38°C预杂交lh,吸取多余液体,不洗;
[0045] (6)杂交:用C液稀释A液至50 μ g/ml,每张切片加20 μ 1,盖上盖玻片,恒温箱 42°C,杂交过夜。
[0046] (7)杂交后洗涤:揭去盖玻片,37°C 2XSSC洗涤2次,每次5min;0.5XSSC洗涤 15min ;0· 2 X SSC 洗涤 15min ;
[0047] (8)滴加稀释后的D液(使用前10000rpm/min离心5min,吸取上层液体稀释10 倍),37°C 30min ;
[0048] (9)按照I :2000抗体效价,滴加 E液,37°C 60min,PBS洗4次,每次5min ;
[0049] (10)将玻片放入检测缓冲液(0· IM Tris-HCl、0.1 M NaCl,pH 9. 0)平衡 2min ;
[0050] (11)显色:将玻片放到用检测显色液稀释后的F液中避光孵育显色(40 μ I F液, 2ml检测缓冲液)显微镜下控制显色;
[0051] (12)显色完全后,PBS清洗IOmin ;二甲苯脱色,封片,观察。
[0052] 结果观察:
[0053] 地高辛标记的特异性探针与细胞内寄生的微孢子虫特异性地结合,经碱性磷酸酶 染色后呈深蓝紫色。所检测的健康中华绒螯蟹无特异性信号(图1),轻度感染微孢子虫的 中华绒螯蟹阳性信号点较少,零星分散(图2),重度感染微孢子虫的中华绒螯蟹信号聚集, 集中于肝胰腺的上皮中(图3)。
【主权项】
1. 中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针,序列如SEQIDNO. 1所示 2. SEQIDNO. 1所示序列作为中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针的应用。3. 权利要求1所述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针在制备中华绒螯蟹微孢 子虫的原位杂交检测试剂盒中的应用。4. 一种中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测试剂盒,包括原位杂交检测试剂,其特征 在于,还含有由权利要求1所述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针制备的特异性探 针。5. 根据权利要求4所述的中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测试剂盒,其特征在于, 包括: (1) 含特异性探针的A液,所述特异性探针是指地高辛标记的权利要求1所述检测探 针; (2) 含蛋白酶K的B液, (3) 促进探针结合的C液:DigEasyHybGranules,Roche, (4) 封闭非特异性蛋白位点的D液:10X,Blockingsolution,Roche, (5) 含有碱性磷酸酶标记地高辛抗体的E液, (6) 用于显色的F液:50XNBT/BCIP。
【专利摘要】本发明公开了中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒。所述探针的序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述探针用地高辛标记,与中华绒螯蟹组织切片中的微孢子虫18S小亚单位核糖体DNA(18S?SSU?rDNA)杂交结合后,经碱性磷酸酶检测系统显色,在显微镜下观察即可判断微孢子虫的感染。本发明还提供了含有该探针的试剂盒,该试剂盒特异性好,操作简便,能直观地将病原检测与病理变化结合起来;在高效、准确检测螺原体的同时,由样本切片上分析感染率和感染强度;由于探针与18S?SSU?rDNA的杂交是特异的,且信号经过了逐级放大,所以较常规的染色观察检测灵敏、精确;而且检测结果杂交显色后的切片可长期保存。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177165
【申请号】
【发明人】丁正峰, 薛晖, 刘洪岩, 孙梦玲, 赵彦华
【申请人】江苏省淡水水产研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月26日
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