一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种十分安全可靠的非还原性双糖，费雷德里克率先应用核磁共振技术 对其化学结构进行了探究，有2个吡喃型葡萄糖单体通过1，1糖苷键连结而成的双糖。十九 世纪上半叶由威格斯从一种黑麦的麦角菌中把海藻糖第一次提取获得，并且已经证实了海 藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。又因为其耐干旱、抗低温、抗严寒等特 性，被很多人称为"生命之糖"。海藻糖能使生物体忍受高温、高寒、高渗透压及干燥失水等 恶劣的环境条件，原因是它能够产生一种膜附着在细胞表面，较好地维持蛋白分子不发生 变性，进而使得动植物生命特性得以存在。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为 蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类 化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品 配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景 和巨大的经济效益。
[0003] 鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研 究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生 产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并 作为短期可见效的可行性途径之一。
[0004] 海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶，它只需要 一步反应就可以将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α_1，1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程 短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海 藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到 广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同 微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但其在反应过程中均伴有副产 物的产生，有的高达20%，一般为5%_10%左右，这对下游产物的分离纯化带来了难度，同 时提尚了海澡糖的生广成本。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应 用。该突变的海藻糖合酶副产物葡萄糖的生成量降低，海藻糖的转化率提高。该海藻糖合酶 由来源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶经定点突变Α309Ε获 得。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本发明所述海藻糖合酶是通过Quick change定点突变的方法对关键氨基酸309位 的丙氨酸突变为谷氨酸，然后转入大肠杆菌进行高效表达后，利用镍柱亲和层析，离子交换 层析，分子筛等一系列纯化手段，最终获得高纯度的海藻糖合酶突变体蛋白。上述重组蛋白 反应2h即可达到最大转化率，海藻糖转化率即可达到74.7%，副产物仅为1.1%。上述重组 蛋白在50°C金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到51.2%。上述重组蛋白最适反 应温度为35°C。上述重组蛋白最适反应pH为7.0-8.0。
[0010] -种插入上述突变的海藻糖合酶的表达基因的重组载体。
[0011] -种转基因细胞系，含有上述重组载体。
[0012] 上述突变的海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶 中的应用。
[0013] 上述突变的海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
[0014] 本发明所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Qlu3中获 得，具体方法为:对商品化的pET-15b载体的多克隆位点进行改造，删除掉多余的酶切位点， 保留BamHI，XhoI，EcolI，Hindin酶切位点，并在其中加入了Prescission酶切位点，获得 pGLOl载体。将该基因连接到pGLOl载体上构建成质粒，然后利用Quick change定点突变的 方法对关键氨基酸309位的丙氨酸(A)突变谷氨酸(E)，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行 原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方 法分离获得高纯度的突变体海藻糖合酶。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明首次根据(Pseudomonas stutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性 中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶 制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，并且海藻糖转化率由野生型的71.5%提高到 74.7%，副产物由野生型的3.6%降低至1.1 %，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化 率提高了4.5%，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4%。可以降低海藻糖与葡萄糖的分离成 本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础;也为其他相似蛋白提高转化率提供了可行性方法。
【附图说明】
[0017] 图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；
[0018] 图中：M、Marker，T为TreS-pET-15b 的目的条带；
[0019]图2为镍柱纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳结果图片；
[0020]图中，ce:破碎后全菌液，s:高速离心后上清，elu:镍柱洗脱后蛋白；
[0021 ]图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；
[0022] 图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；
[0023] 图5A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线图；
[0024]图5B纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线图；
[0025]图6A为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线图；
[0026]图6B纯化后海藻糖合酶pH稳定曲线图；
[0027]图7A为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对海藻糖转化率影响的曲线图；
[0028] 图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶；
[0029] 图7B为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对葡萄糖转化率影响的曲线图；
[0030] 图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0032]实施例1:克隆得到突变的海藻糖合酶基因。
[0033] 依据NCBI上公开的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)海藻糖合酶全长核苷 酸序列设计突变点处的引物，引物序列如下：
[0034] 上游引物:GTGGCCCTCCGACCAttcGGTGCC
[0035] 下游引物：CGTGCCGAGGGCACCgaaTGGTCG
[0036] 以构建好的tres-pGLOl质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如 下：
[0038] 上述PCR反应按照如下程序进行：
[0039] 98°C 预变性 3min; 98°C 变性 10s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 4min，25 个循环；72°C 终延 伸lOmin。
[0040] PCR结束后通过lwt%的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短。
[0041 ]实施例2:将突变的海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。
[0042] PCR产物经Dpnl内切酶酶切反应，酶切反应体系如下：
[0043] PCR产物的酶切体系：
[0045] 充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，37°C连接反应30min。
[0046] 重组质粒的转化
[0047] (1)感受态细胞的制备
[0048] ①挑取大肠杆菌BL21(DE3)(购自上海前尘生物科技有限公司）单菌落(或挑取保 存菌种)接种至l〇ml液体LB培养基中，37°C，210rpm过夜培养；
[0049] ②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37°C，210rpm，摇70-80min至0D6QQ达到 0.375；
[0050] ③将菌液放置于冰水混合物上lOmin，同时预冷50ml离心管；
[00511④将菌液转移到离心管中，4°C，3700rpm，lOmin收集菌体，弃上清；
[0052]⑤每个离心管中加入大约10ml冰预冷的激活缓冲液(0.1M CaCl2)，用灭过菌的 5ml枪尖打散沉淀，然后再向每个管中加大约30ml冰预冷的激活缓冲液，颠倒混匀，冰上静 置20min;
[0053] ⑥4°C，3700rpm，离心10min;弃上清，将残液倒净，按500ml菌液12ml冰预冷储存 buffer(0.1M CaCl2，体积百分比15 %甘油）的量，将沉淀打散，（分次转移，然后吹吸打散）。 [0054] ⑦将感受态细胞分装到冰预冷的灭菌EP中，每管100微升，置于冰上(0°C)30min。
[0055] ⑧感受态-80°C冻存，制得感受态细胞BL21 (DE3)。
[0056]注意：整个过程尽量让细胞处于低温，所用的枪尖，离心管，EP管和buffer等均要 灭菌，整个过程都在超净台里操作，感受态细胞做完后要test其效率和是否染菌。
[0057] (2)连接产物转化
[0058] ①将15yL连接产物加入lOOyL新鲜制备的感受态细胞BL21DE(3)中，轻轻混匀，冰 浴30min。
[0059] ②42°C热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min。
[0060] ③加入200yL LB液体培养基，37