用于沙门氏菌与大肠杆菌o157:h7的多重pcr-elisa检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种食品安全检测技术，具体涉及用于沙门氏菌 与大肠杆菌〇157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌（Salmonella spp.)是近年来国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要 引起人类伤寒、急性肠胃炎、菌血症与败血症等病症。该菌分布广泛，多种动物上都分离到 该菌，尤其是广泛存在于鸭、鹅等水禽及其蛋类之中，带菌率为30%-40%，家畜与家禽的生 前感染与宰后易受污染。人类感染主要是由于食品、饮用水以及环境受到沙门氏菌污染引 起的，根据我国疾病预防控制中心公布的中国内陆地区食源性致病菌导致疾病人数统计数 据，感染沙门氏菌的病例在整个细菌性食物中毒病例中占据首位。因此国内外对沙门氏菌 的监测都非常重视。大肠杆菌0157:!17化8(*64(^丨3(3〇1丨0157 :!17)也是近年来国内外广 泛重视的人畜共患病原菌，主要引起腹泻、出血性肠炎与严重继发溶血性尿毒综合症等病 症。该菌分布广泛，人与动物的排泄物是大肠杆菌〇157:H7的重要传播载体。多种动物上都 分离到该菌，尤其是大肠杆菌0157 :H7能寄生于牛、猪、鸡、羊、狗等家畜，通过苍蝇、蟑螂和 蚊子等媒介动物传播，随着人和动物的排泄物污染生活用水、湖泊、河流等地表水传播以及 人与带菌家禽等的接触传播等。人类感染主要是由于大肠杆菌〇157:H7污染的食品、饮用水 以及环境引起，20世纪末，我国河南、安徽、江苏等地都有大肠杆菌0157:H7大面积暴发，疫 情广泛、严重，确诊人数总计达2万人，导致177人死亡。大肠杆菌0157: H7感染的病例在整个 细菌性食物中毒病例的致死率居于前列。因此国内外对大肠杆菌〇157:H7的监测都非常重 视。
[0003] 目前检测食品中致病菌的方法主要以传统方法为主，但是常规的分离培养与生化 鉴定耗时费力、敏感性不高、所需时间长，不利于暴发疫情时的快速诊断，也不符合临床病 原菌检测所要求的快速、准确的原则。尽管国内外对沙门氏菌与大肠杆菌〇157:H7的诊断技 术已进行较为广泛与深入的研究，但缺乏快速、简便、经济的检测技术。近年来发展起来的 PCR技术，是一种快速、敏感、特异的检测技术，然而由于该技术判定反应结果时的凝胶电泳 易造成污染并需要接触有毒性的染料而具有局限性。此外，荧光定量PCR技术也因其敏感性 高、特异性强而得到广泛应用，该法的局限性表现在设备昂贵、成本高与荧光探针保存时间 较短等方面。上述方法在高通量检测方面也显得较为繁琐，RiboPrinter全自动细菌鉴别系 统(ΒΑΧ系统）与基因芯片技术能够进行高通量的检测，不过前者仪器本身及所用耗材与试 剂均较昂贵，后者的检测稳定性较差，这些方法均不能满足对沙门氏菌与大肠杆菌〇157:Η7 快速、准确、稳定、经济、高通量的实际检测需求。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是：目前检测食品中致病菌的方法主要以传统方法为 主，但是常规的分离培养与生化鉴定耗时费力、敏感性不高、所需时间长，不利于暴发疫情 时的快速诊断，也不符合临床病原菌检测所要求的快速、准确的原则。本发明针对上述缺 陷，目的在于提供一种敏感性高、特异性强、方便快捷的用于沙门氏菌与大肠杆菌0157:H7 的多重PCR-ELISA检测的试剂盒及应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种用于沙门氏菌与大肠杆菌0157: H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒 包含引物组、探针、PCR模板、PCR反应液以及ELI SA反应液。
[0007] 所述引物组由沙门氏菌引物对和大肠杆菌引物对组成。
[0008] 所述引物组具体为，沙门氏菌上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示;大肠杆菌上游引物如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
[0009] 所述沙门氏菌上游引物和大肠杆菌上游引物的5 '端均为地高辛标记。
[0010] 所述探针包括沙门氏菌探针如SEQ ID N0:5所示、大肠杆菌探针如SEQ ID N0:6所 不。
[0011] 所述沙门氏菌探针和大肠杆菌探针的3'端均为生物素标记。
[0012] 所述PCR模板为DNA，由增菌培养液培养而成。
[0013] 所述PCR反应液包括PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶和ddH20。
[0014] 一种用于沙门氏菌与大肠杆菌0157 :H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒的应用，其特 征在于，按照以下步骤进行：
[0015] (1)多重PCR:PCR模板各lyL，lOpmol/yL沙门氏菌上下游引物各0 · 3yL，10pmol/yL 大肠杆菌上下游引物各0.4yL，10XPCR buffer 2.5yL，25mmol/L MgCl2l.5yL，2.5mmol/L dNTPs 0.3yL，5U/yL Taq酶0.8yL，ddH20定容至25yL;反应程序为94°C变性5min，94°C变性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸7min，各物料的用量可同比例放大或 缩小；
[0016] (2)以含有8mg/L链霉亲和素的包被液，包被酶标板，200μLν孔，4°C包被过夜，甩干 后以含0.5mL/L Tween-20的TOST洗板5次，250μ!7孔，每次静置3min，甩干，所述包被液为 0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.8;
[0017] (3)40yL变性液中加入5yL地高辛标记的PCR产物，混匀，室温静置30min，再加入 200yL 50pmo 1/L生物素标记的探针，混匀，每孔加入上述杂交液200yL，55°C2h，洗板，所述 变性液为 100mm〇l/L NaOH溶液，750mmol/L NaCl;
[0018] (4)加入100yL以PBS按1:5000稀释的HRP标记的抗地高辛抗体，37°Clh，洗板5次；
[0019] (5)加入50yL临时配制的lmg/mL TMB显色液，室温避光显色10min，加入20yL H2S〇4 终止。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] (1)本发明建立了沙门氏菌与大肠杆菌0157: H7的多重PCR-ELI SA检测试剂盒，本 试剂盒根据沙门氏菌的invA基因与大肠杆菌0157:H7的rfbE基因的保守区域设计引物与探 针。相对于普通的多重PCR检测方法，多重PCR-ELISA加入了杂交探针，使得此方法能够准确 检测到样品中目的基因片段，而不是单纯检测扩增产物分子量的大小，从而增加了检测的 特异性，使得此方法能够准确鉴定样品。本方法采用了链霉素-亲和素-地高辛-抗地高辛抗 体系统，对比普通的多重PCR与ELISA检测，由于双标记物的存在，此检测法在敏感性上有了 提高;在结果的判定上，此法采用ELISA的显色反应，使结果的判定更加直接。
[0022] (2)本发明所建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、使用范围广的 优点。所需要的仪器为PCR仪与酶标仪，普通实验室就有配置，试剂与耗材已有商品化的成 品，容易购买，利于推广。本发明在96孔酶标板中进行，成本低廉，适用于对沙门氏菌与大肠 杆菌0157: H7进行大规模、高通量的检测。
【附图说明】
[0023] 图1为单项PCR扩增，其中Μ为DNA Marker，1为沙门氏菌，2为大肠杆菌0157:H7，3为 阴性对照，4为空白对照；
[0024] 图2为多重PCR引物特异性，其中Μ为DNA Marker，1为大肠杆菌0157: H7，2为肠炎沙 门氏菌，3为鼠伤寒沙门氏菌，4为金黄色葡萄球菌，5为大肠埃希氏菌，6为单增李斯特氏菌， 7为痢疾志贺氏菌，8为福氏志贺氏菌，9为阴性对照；
[0025] 图3为多重PCR敏感性，其中Μ为Marker，1-9为沙门氏菌与大肠杆菌0157 :H7菌体浓 度分别依次为 108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、10 5CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/ mL、lOkFU/mL、lOtFU/mL的扩增结果，10为阴性对照；
[0026] 图4为特异性分析；
[0027]图5为敏感性分析，其中X为细菌数量;A为沙门氏菌;B为大肠杆菌0157: H7。
【具体实施方式】
[0028] 一种用于沙门氏菌与大肠杆菌0157: H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒 包含引物组、探针、PCR模板、PCR反应液以及ELI SA反应液。
[0029] 所述引物组由沙门氏菌引物对和大肠杆菌引物对组成。
[0030] 所述引物组具体为，沙门氏菌上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示;大肠杆菌上游引物如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。