硝酸盐防治骨质疏松的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及硝酸盐及其相关制剂在预防和治疗骨质疏松方面的新用途，属于医药卫生领域。
【背景技术】
[0002]硝酸盐是自然界广泛存在的一种无机物，植物能够吸收和利用土壤中的硝酸盐以供应体内所需的氮元素。食物中的硝酸盐大部分来源于绿色蔬菜中。传统的观点认为，饮食中的硝酸盐和亚硝酸盐类具有潜在的致癌倾向，随后人们认识到，亚硝酸盐只有跟胺类物质结合形成亚硝酸胺类化合物，且达到一定的浓度时，才会显现出致癌作用。目前，硝酸盐及其下游通路产生的一氧化氮(Nitric 0xide，N0)在降低血压，调节血管张力，承担神经信号传递信号分子和免疫调节等方面的确切作用已经达到共识，这种通过外源性硝酸盐的加载，增加体内硝酸盐及其下游通路NO等的表达水平，为某些疾病的防治开辟了一条新的途径。
[0003]骨质疏松症是老年人，尤其是绝经妇女最常见的一种退行性骨代谢性疾病，以全身性骨量减少、骨组织显微结构退变、骨强度降低、骨脆性增加、易骨折和全身疼痛为主要病变特点。目前，临床上治疗骨质疏松的药物可分为抗骨吸收药物、促进骨形成药物和促进骨矿化药物等，其中最常用的是雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy ,ERT)，其疗效已经得到充分肯定，然而长期使用雌激素有增加子宫内膜癌、乳腺癌和心血管疾病的风险。
[0004]目前，尚未有研究或专利报道硝酸盐饮食在预防和治疗骨质疏松方面的应用。
【发明内容】
[0005]本发明人发现，给予去势大鼠的饮水中添加硝酸盐可以明显缓解大鼠骨量的丢失，而且硝酸盐在保存骨量的同时未发现明显不良反应，对大鼠体重没有明显影响。
[0006]我们发现，采用富含硝酸盐的饮食可以调节骨代谢，其每日摄取的硝酸盐浓度为
0.5mmol/Kg即可。
[0007]我们发现，硝酸盐饮食可以改善去势大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)的生物学行为，增强BMMSC的成骨分化能力。
[0008]本发明同时表明，硝酸盐饮食可以改善去势大鼠的免疫调节能力，有助于其调节骨代谢。
[0009]本发明的发现可应用于预防、治疗骨质疏松及相关骨代谢异常疾病，对干细胞异常及免疫异常等疾病的治疗也具有借鉴意义。
【附图说明】
[0010]图1为硝酸盐饮食缓解去势大鼠骨量丢失。大鼠胫骨上部MicroCT示去势组胫骨骨量明显丢失，应用硝酸盐后明显恢复去势大鼠胫骨丢失的骨量。(A)实验流程示意图，12周龄SD大鼠去势手术的同时给予硝酸钠饮水，12周后处死动物收集标本。(B)大鼠胫骨上部MicroCT示OVX组胫骨骨量明显丢失，应用硝酸盐后去势大鼠胫骨丢失的骨量明显缓解。(C-F)各组MicroCT定量分析示OVX组显著降低了骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)，而硝酸盐组能够部分恢复以上指标(*P〈0.05)。
[0011]图2为硝酸盐饮食对去势大鼠胫骨重量和体重的影响。硝酸盐饮水可缓解去势大鼠胫骨重量的下降，同时对去势大鼠体重的增加没有明显影响。(A)硝酸盐饮水可缓解去势大鼠胫骨重量的下降。(B)硝酸盐饮水对去势大鼠体重的增加没有明显影响(*P〈0.05)。
[0012]图3为硝酸盐饮水3个月后血清中的硝酸盐和亚硝酸盐含量的差异。硝酸盐饮水显著增加血清中硝酸盐及亚硝酸盐的含量。(A)硝酸盐饮水显著增加血清中硝酸盐的含量。(B)硝酸盐饮水显著增加血清中亚硝酸盐的含量(*P〈0.05)。
[0013]图4为硝酸盐饮水对去势大鼠的免疫调节作用。取各组大鼠外周血做流式分析，硝酸盐饮水可缓解去势大鼠调节性T淋巴细胞(Treg)的下降。同时，硝酸盐饮水可缓解去势大鼠TGF-m、IFN-y的下调及IL-17的上调。(A)取各组大鼠外周血做流式分析，硝酸盐饮水可缓解去势大鼠调节性T淋巴细胞(Treg)的下降。(B-D)硝酸盐饮水可缓解去势大鼠TGF-β1、IFN-γ的下调及IL-17的上调(*P〈0.05)。
[0014]图5为硝酸盐饮水改善去势大鼠BMMSC的缺陷。取各组大鼠BMMSC原代培养，取第三代细胞行CCK8检测，结果示硝酸盐饮水显著降低去势大鼠腫MSC的增殖能力。此外，取各组大鼠BMSSC行成骨诱导，并行茜素红染色及定量，显示硝酸盐饮水显著增强去势大鼠BMMSC的成骨分化能力。(A)取各组大鼠BMMSC原代培养，取第三代细胞行CCK8检测，结果示硝酸盐饮水显著降低去势大鼠BMMSC的增殖能力。(B)取各组大鼠BMSSC行成骨诱导21天行茜素红染色并进行定量，示硝酸盐饮水显著增强去势大鼠BMMSC的成骨分化能力(*P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0015]1、骨质疏松模型的建立及硝酸盐给药
[0016]骨质疏松模型选择选择12周龄雌性SD大鼠，摘除双侧卵巢。实验分为3组:Sham组(假手术组)、0VX组(去势组)及Nitrate组(去势+硝酸盐饮水)，每组10只。Nitrate组去势第二天给予硝酸钠饮水，浓度为2.5mmol/L，每只大鼠每日摄取的硝酸盐含量约为0.5mmol/Kgb.w.,连续硝酸盐饮水12周，其余组正常饮水。
[0017]2、骨密度检测
[0018]完整分离大鼠胫骨，剔除所有附着的肌肉和结缔组织，用生理盐水浸泡的湿纱布包裹，-20°C密封保存。应用Skyscanll72型Micro-CT对胫骨上部进行扫描，扫描层厚为9μπι，使用其所附带的软件对骨密度及骨小梁结构进行定量分析。
[0019]3、血清中硝酸盐及亚硝酸盐的测量
[0020](I)配制标准品:倍比稀释原标准品为200-3.125μΜ
[0021](2)亚硝酸盐浓度测定:
[0022]I)加50μ1反应缓冲液于空白孔中；
[0023I 2)向反应缓冲液中加入50μ1样品或标准品；
[0024]3)各孔中依次加入50μ1反应缓冲液；
[0025]4)依次加入50μ1 Griess Reagent I于各孔中；
[0026]5)依次加入50μ1 Griess Reagent II于各孔中，室温孵育10分钟；
[0027]6)酶标仪540nm读取OD值，690nm作为校正。
[0028](3)硝酸盐浓度测定:
[0029]I)加50μ1反应缓冲液于空白孔中；
[°03°]2)向反应缓冲液中加入50μ1样品或标准品；
[0031]3)各孔中依次加入25μ1 NADH ；
[0032]4)各孔中依次加入25μ1硝酸盐还原酶；
[0033]5)依次加入50μ1 Griess Reagent I于各孔中；
[0034]6)依次加入50μ1 Griess Reagent II于各孔中，室温孵育10分钟；
[0035]7)酶标仪540nm读取OD值，690nm作为校正。
[0036]4、免疫指标的检测
[0037](I)大鼠外周血调节T细胞比率检测
[0038]I)各组大鼠腹主动脉取血，离心取上清备用；
[0039]2) ΙΟΟμΙ 0.1 %BSA重悬，加入Anti_CD4，Anti_CD25，冰上孵育30分钟，避光；
[0040]3)1500rpm离心10分钟，去上清，0.1%BSA重悬；
[0041]4)加入破膜液，4°C，10分钟；
[0042 ]5)1500rpm离心1分钟，去上清，0.I % BSA重悬；
[0043]6)加入Anti_Foxp3，冰上孵育30分钟，避光；
[0044]7)离心，去上清，500μ1 0.1% BSA 重悬；
[0045]8)流式细胞仪检测。
[0046](2)TGF-01、IFN- γ 及IL-17的检测
[0047]I)将血清稀释10倍，取0.1ml置入试剂盒96孔板中，同时取试剂盒内标准品按比例稀释后置入96孔板中，按说明书要求室温下/37°C孵育30分钟/I小时，使用洗液洗涤3次，每次3分钟；
[0048]2)加入酶标抗体ΙΟΟμΙ，室温下/37°C孵育15分钟/30分钟，洗涤3次，每次3分钟；
[0049]3)加底物液ΙΟΟμΙ显色，室温下/37 °C孵育15分钟；
[0050]4)加ΙΟΟμΙ终止液终止反应5分钟；
[0051 ]5)酶标仪450nm下读数。
[0052]5、干细胞的增殖及成骨分化
[0053](I)大鼠BMMSC的培养
[0054]脱颈致死后剥去后肢的皮肤，暴露股骨和胫骨后用ImL注射器吸取α-ΜΕΜ完全培养基(含牛血清10%)从断端冲出骨髓，待细胞克隆生长至80%融合可传代，传代培养至第三代。(2)CCK8 法
[0055]在96孔板中接种ΙΟΟμΙ细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(在37°C，5%C02的条件下)，随后将培养板在培养箱孵育72小时，每孔换新的培养基ΙΟΟμΙ，并向每孔加入10μICCK-8溶液。2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0056](3)成骨诱导分化
[0057]配制成骨诱导培养液:含10%胎牛血清α-ΜΕΜ培养基中加入2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100yg/ml链霉素，ΙΟπιΜβ-甘油磷酸钠，1nM地塞米松，50mg/L维生素C。第3-4代细胞以2X103/cm2的浓度接种于6孔板中，等细胞生长至80%融合后，更换为成骨诱导培养液，每2天换液I次，光镜下观察钙结节形成情况。于诱导2周后，进行茜素红染色。
[0058](4)茜素红染色
[0059]I)去培养基，PBS洗2次；
[0060]2)70% 乙醇固定，4°C，lh;
[0061]3)双蒸水洗2次；
[0062]4)40mM茜素红溶液(pH 4.2)室温染色1-10分钟，肉眼观察着色情况；
[0063]5)双蒸水洗5次，轻轻吹打；
[0064]6)镜下观察并采集图像；
[0065]6、统计学方法
[0066]采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，多组计量资料比较采用ANOVA分析，P〈0.05有统计学意义。
【主权项】
1.硝酸盐用于骨质疏松及相关骨代谢疾病的预防和治疗。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙及其组合，包括富含硝酸盐的食物及提取物。3.根据权利要求1-2所述的应用，其特征在于，所述的防治骨代谢疾病的药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、糖浆、口服液、颗粒剂或贴剂。要求保护硝酸盐用于以上治疗时的每天给药剂量0.5mmol/Kg b.w.。4.硝酸盐负载对机体免疫异常的调节作用。5.硝酸盐负载对骨髓间充质干细胞异常相关疾病的调节作用。
【专利摘要】本研究选择12周龄去势SD大鼠为研究对象，每天给予硝酸钠饮水(0.5mmol/Kg？b.w.)，3个月后处死动物收集胫骨、血液、骨髓等标本，首先，我们采用MicroCT技术对各组胫骨的骨小梁结构进行定量分析，结果发现OVX组胫骨骨量明显丢失，应用硝酸盐后去势大鼠胫骨丢失的骨量明显缓解，硝酸盐饮水在恢复胫骨的质和量的同时对大鼠体重无明显影响，其次，我们采用流式细胞术及干细胞培养等技术方法对各组大鼠的免疫调控及干细胞活性进行检测，发现硝酸盐饮水可以调控去势大鼠的免疫及骨髓间充质干细胞生物学行为，总之，我们首次发现硝酸盐饮水可以缓解去势大鼠的骨质疏松，这可能是通过硝酸盐调节免疫及骨髓间充质干细胞实现的。
【IPC分类】A61P19/08, A23L2/52, A61P19/10, A23L33/16, A61K33/00, A61K33/06
【公开号】CN105596361
【申请号】CN201510634301
【发明人】王松灵, 庞宝兴, 曲兴民
【申请人】王松灵
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年9月30日