一株高效分泌d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株及其构建方法，以及将基因工程菌株用于发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。
【背景技术】
[0002]稀少糖是存在于自然界中但含量极少的一类单糖及衍生物。随着人们对这类糖逐步了解，以阿洛酮糖与塔格糖为核心的功能性稀少糖研究得到迅速的发展，并引起众多研究者的关注。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一种稀有糖，它是D-果糖在C3位置的差向异构体。D-阿洛酮糖极其少量地存在于某些商业化的糖类和农产品中，并且很难通过化学方法进行合成。比如，D-阿洛酮糖存在于小麦、甘蔗和甜菜糖蜜中，也少量地存在于商业化的D-葡萄糖和D-果糖中。
[0003]D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%，然而其能量值仅为0.007 kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3%，所以D-阿洛酮糖是一种非常理想的低卡路里甜味剂。D-阿洛酮糖已经被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积。D-阿洛酮糖针对6-羟多巴胺诱导的细胞凋亡具有神经保护作用，也可以抑制因高含量葡萄糖刺激产生的单核细胞趋化性蛋白-1的表达，因此D-阿洛酮糖在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面有很高的医疗价值。在食品行业中，D-阿洛酮糖因为其甜度、高溶解度、极低卡路里和很低的血糖反应的特点而被视为一种理想的蔗糖替代品。向食物中添加D-阿洛酮糖可以增加食物的凝固作用，且阿洛酮糖可以通过与食物蛋白产生美拉德反应而使食物具有更好的味道。与D-果糖和D-葡萄糖相比，D-阿洛酮糖可以产生更多抗氧化的美拉德反应产物，以使食物维持较高的抗氧化状态，从而具有更长的保质期。此外，还有报道称D-阿洛酮糖可以提高蛋清蛋白的起沫性能以及黄油饼干的质量。总之，D-阿洛酮糖在食品、保健及医药品领域有着十分重要的应用价值。
[0004]2011年8月，D-阿洛酮糖被Π)Α认定为是安全的(GRAS)，并且被允许在一定范围的食物和食品中用作添加剂。因此，D-阿洛酮糖具有广阔的市场前景。据我们所知，D-阿洛酮糖只在日本(Matsutani Chemical Industry C0., Ltd, and Raresweet C0.Ltd.)和韩国(CJ Cheiljedang, Inc.)实现了工业化生产。目前，生产D-阿洛酮糖的技术主要包括提取法、化学合成法和生物转化法。但是D-阿洛酮糖在自然界中的含量极低，提取法明显不适宜D-阿洛酮糖的大规模生产;化学合成法不仅成本高、产量低，而且会产生比较严重的环境污染。生物转化法可以利用自然界广泛存在的单糖或某些单糖的加工副产物为原料，不仅成本较低，而且转化效率也远远高于提取法，是规模化制备D-阿洛酮糖的重要技术手段。使用DTEase家族的酶通过差向异构作用使D-果糖与D-阿洛酮糖之间进行相互转化是生物转化法生产D-阿洛酮糖的主要方法。DTEase家族酶类的基因有多种来源，但是目前只有少数几种酶得到比较系统的研究。1993年，Izumori et al ( 1993 )首次报道了来源于Pseudomonas cichorii ST-24的一种新酶，发现该酶可以催化酮糖在C3位置的差向异构，其最适底物为D-塔格糖，因此将其命名为D-塔格糖3-差向异构酶。Kim et al (2006)报道了来源于Agrobacterium tumefaciens的DTEase酶类的另一种特性，即可以特异性催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化，因其对D-阿洛酮糖的底物特异性最高，遂将其命名为D-阿洛酬糖 3_差向异构酶(DPEase)。近年来，来自 Rhodobacter sphaerof ides SK011、Clostridium celluloyticm H10、Ruminocossus sp.5_l_39BFAA、Clostridium scindensATCC35704、Desmospora sp.8437 和Clostridium bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因也陆续被克隆和表达，其酶学性质也被详细地研究。
[0005]到目前为止，文献和专利中的DPEase酶类主要在大肠杆菌中进行表达，大肠杆菌外膜包含脂多糖，是一种可以引起人类和哺乳动物发热的内毒素，而终产物中内毒素的去除则明显加大了产物纯化的复杂性;此外，在大肠杆菌中，蛋白的合成通常发生在细胞内，为了获得大量的目标蛋白，需要将细胞进行破坏以使细胞内的蛋白释放出来，这一附加的过程势必将增加蛋白的生产成本。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌。其生产的蛋白可以被大量释放到培养基中，从而大大缩减下游的蛋白纯化过程，显著降低目标蛋白生产成本;同时枯草芽孢杆菌细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA已将其列为GRAS (Generally Recognized As Safe)级别的微生物。因此，采用枯草芽孢杆菌进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产比大肠杆菌具有更大的优势。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供含有编码来源于瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的各种重组表达质粒。
[0007]所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本发明的目的之二是提供一株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株1A751SD-XR，是将来源于质粒pMA5且包含木糖启动子PxyIA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的重组质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢杆菌168、14751、18600、18700、18800或以上菌株后代细胞中的一种。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis 1A751。
[0010]本发明的目的之三是提供该高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因工程菌株的构建方法，主要包括以下步骤= (I)PCR扩增或化学合成rdpe基因序列；(2)将rdpe基因插入表达质粒PMA5，构建重组表达质粒pMA5-RDPE ； (3)将pMA5_RDPE转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株1A751-HR;(4)以三个诱导型启动子PxylA、Pglv和PsacB替换pMA5-RDPE上的组成型启动子 Ρ_π，分别构建重组表达质粒 pMA5-PxyiA-RDPE、pMA5-Pgiv—RDPE 和 pMA5-PsacB-RDPE。(5)将 pMA5-PxyiA_RDPE、pMA5-Pgiv-RDPE 和 pMA5-Psac；B-RDPE 分别转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌 1A751-XR、1A751-GR 和 1A751-SRJ6)敲除基因 xylAB(xylA 和 xylB)，获得菌株 1A751SD，导入重组表达质粒pMA5-Pxy ia-RDPE，从而获得基因工程菌株IA751SD-XR。
[0011]在本发明的一种实施方式中，重组表达质粒PMA5-RDPE上的启动子Pfipall分别被诱导型启动子PxyIA、Pglv和PsacB替换。
[0012]本发明的目的之四是提供应用上述基因工程菌分泌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，主要包括以下步骤:将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以0.5%?5%接种量转入装液量50%?70%的发酵罐中，通气量1.0?2.0 vvm，搅拌转速100?800 rpm，pH不作控制，于37 °C培养;待发酵液OD_稳定后以恒定流速进行补料;发酵培养基成分为2.0%?4.0%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物、0.3%-0.9%磷酸氢二钾和1.0%-3.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2;补料培养基为2.0%?8.0%可溶性淀粉。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD6qq达到0.8时添加一定浓度的诱导物。
[0013]在本发明的一种实施方式中，将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以1.0%接种量转入装液量60%的发酵罐中，通气量2.0 vvm,搅拌转速200?600 rpm，pH维持在7.2，于37 0C培养;发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氢二钾和2.0%可溶性淀粉，初始PH 7.2;补料培养基为8.0%可溶性淀粉。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD6qq达到0.8时添加一定浓度的诱导物。
[0014]本发明的目的之五是提供一种高效表达分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，以重组表达了瘤胃菌来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE。
[0015]在本发明的一种实施方式中，构建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR、1八751-31?或147513011?;发酵培养基为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%?0.9%磷酸氢二钾;于37°C、200rpm摇瓶发酵。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD600达到0.8时添加一定浓度的诱导物。
[0016]本发明相比现有技术的有益效果:本发明首次以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了瘤胃菌来源D-阿洛酮糖3-差向异构酶的高效分泌表达，重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶的分泌量达到2.6 g/L，约占上清液总蛋白量的70%，酶活力约为95 U/mL。该产量是国际上已有报道的最高表达分泌水平。目前D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产宿主大多采用大肠杆菌且在胞内表达，纯化蛋白前需要进行复杂的细胞破碎处理。本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶，大大简化了蛋白纯化流程且明显降低了