一种酯酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明克隆表达了一种酯酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和 应用，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，FAEs)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，是 能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放游离阿魏酸的酶。它能切断 细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的 释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。在食品工业中，利用酯酶来降解 植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原 材料通过酯酶的处理细胞壁变得疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，作为 制浆造纸工业的原料可以减少制浆工序化化学药品的使用，减少污染，并有利于后续工序 的进行。
[0003] 1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces 〇1 ivochromogenes中被第一次发现。研究表 明真菌、细菌、酵母都能分泌酯酶，目前发现的产酶微生物有黑曲霉（Aaspergillus niger)，链霉菌（Streptomyces avermitilis)，梭菌（Clostridium thermocellum)，乳酉爱杆 菌(Lactobacilli sp.)，假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但绝大多数酯酶是从真 菌中分离出来。研究发现约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)有较强的阿酸酯酶活性， 并且已经从中克隆表达出2个阿魏酸酯酶的基因 （Biochemical Properties of Two Cinnamoyl Esterases Purified from a Lactobacillus johnsonii Strain Isolated from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats,Applied and environmental microbiology，2009,5( 15)，5018-5024)。通过对约氏乳杆菌的特性研究，该菌可能还有其 它的酯酶。本专利公开了一种新型的约氏乳杆菌酯酶。
【发明内容】
[0004] 本发明从约氏乳杆菌中克隆得到了一个新型的酯酶基因，利用大肠杆菌工程菌异 源表达，公开了其相关的酶学特性。并用它进行了阿魏酸提取的应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 1、菌株
[0007] 本发明酯酶基因的来源菌株为：Lactobacillus johnsonii ATCC11506(从美国 ATCC菌种库购买）。
[0008] 2、酯酶基因的克隆
[0009] 提取Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌体基因组总DNA。设计特异性引物， 应用PCR方法，扩增出酯酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
[0010] 3、酯酶表达与纯化
[0011]将重组质粒导入BL21大肠杆菌中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，再纯化后冷 冻干燥备用。
[0012] 4、酯酶酶学性质
[0013] 以阿魏酸甲酯为底物研究pH对本发明所述酯酶酶活的影响。
[0014] 以阿魏酸甲酯为底物研究温度对本发明所述酯酶酶活的影响。
[0015] 以阿魏酸甲酯为底物测定了卩62+、厶8+、卩63+、1(+、〇 &2+、〇12+、1%2+、1112+、211 2+、8&2+离子 对酶活的影响。
[0016] 酯酶的底物特性分析:所用的底物有己酸乙酯、葵酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙 酸乙酯、乙烯葵酸酯、巴豆酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、甲 基丙烯酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、乙酸乙烯酯、甘油三丁酯、γ-戊内酯、乙酸丁 酯、三-0-乙酰基-D葡萄烯糖、三乙酸甘油酯、a_D( + )五乙酰葡萄糖、乙酸香叶酯、乙酸正丙 酯、乙酸异丙烯酯、乳酸甲酯、二氢茉莉酮酸甲酯、辛酸甲酯、己酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴乙 酸甲酯、甲基(R)-(-)-扁桃酸、溴苯乙酸甲酯、肉桂酸卞酯、乙酸-2-萘酯、丙酸萘酯、乙酸苯 酯、丁酸萘基酯、4-硝基苯基辛酸酯、乙酸-1-萘酯、2,6_二羟基-4-甲基苯甲酸甲酯、萘酚丙 酸酯、甲基扁桃酸酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯、绿原酸、迷迭香酸、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙 酯、对羟基肉桂酸甲酯。
[0017] 酶活测定方法为:4ml反应体系，包含3ml磷酸缓冲液，1ml底物溶液(4mg/ml底物）， 5ug冷冻干燥的酶，水浴控温反应4h，沸水浴100 °C加热3分钟终止反应。用高效液相色谱检 测底物减少量，高效液相色谱检测条件为：〇-1511^1110%乙腈，90%水(0.1%甲酸）；15-2011^11100%乙腈，0水 ；20-301^1110%乙腈，90%水（0.1%甲酸），检测器为411七6(* 3300型 蒸发光散射检测器。温度、PH、离子、底物的影响均采用该体系。
[0018] 5.以去淀粉麸皮为原料，添加该酯酶后的阿魏酸释放率分析。
[0019] 去淀粉麸皮按照文献的方法制备（Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme and Microbial 丁〇(：1111〇1〇区7，1988，10(7):403-409.)。鼓皮中 阿魏酸的总量以碱法提取得到的阿魏酸计算(Preparation of ferylic acid from agric μLtural wastes: Its improved extraction and purification. Journal of Agricu ltural and Food Chemistry，2008,56(17) :7644-7648.)。阿魏酸释放率为阿魏酸的酶解 释放量占碱提取的阿魏酸总量的百分率
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 本实施例为本发明所述酯酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
[0022] l、Lactobacillus johnsonii ATCC11506DNA的提取
[0023] 将Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌株在LB培养基中培养 12小时，12000r/ m i η离心10分钟得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司）按照其操作提取 Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
[0024] 2、大肠杆菌感受态制备
[0025] (1)接种E.coli DH5a和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37 °C、200rpm/min培养过夜。
[0026] (2)按1%接种量接种于50mL LB培养基中，37°C培养至0D600约0.6(约2~3h)。
[0027] (3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4°C离心 5min〇
[0028] (4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaC12溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min， 8000rpm/min、4°C 离心 5min。重复 2次。
[0029] (5)弃上清，加入1.5mL预冷的0 . lmol/LCa