一种利用重组嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001]—种利用重组嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等方面。在医药方面，反式-4-羟脯氨酸作为原料可用于合成消炎药、碳青霉烯类。在化工上，反式-4-羟脯氨酸可作为手性原料合成多种聚合物。在动物饲料应用上，添加反式-4-羟脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养不良现象。反式-4-羟脯氨酸用于高级化妆品中，可消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态。
[0003]目前，国内生产反式-4-羟脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用动物蛋白来源，如明胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟脯氨酸。该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重；而化学合成方法合成成本高，也不适合工业生产。随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，生物合成酶法生产羟脯氨酸成为工业上很有前景的生产方法。
[0004]生物合成法能将游离的L-脯氨酸通过脯氨酸羟化酶的催化，转化为羟基-L-脯氨酸，但在生物细胞中，游离的脯氨酸也是一种可以被利用的碳源，其积累量比较有限，选用能够大量生产L-脯氨酸的菌株作为羟基-L-脯氨酸生产菌株是非常重要的。
[0005]1956年Kinoshita等最先从土壤中分离到可以积累谷氨酸的微生物Micrococcusglutamicus N0.534，自此之后产谷氨酸菌种被陆续发现，目前根据生理生化等特征将这类产谷氨酸细菌统称为C.glutamicum。本研究所用的嗜乙酰乙酸棒杆菌C.acetoacidophilum也是其中的一种。谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性菌，是一般公认安全物质(GRAS)，是工业生产氨基酸的重要菌种。且此菌无致病性、不产孢子、自身胞外蛋白酶分泌缺失，食品安全性好。
[0006]实验室保藏菌种嗜醋酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)N0.45是一株两抗型【磺胺胍(SG)和硫代脯氨酸(L-S-Pro)有抗性】菌株，该菌株经由硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理得到。此菌L-脯氨酸产量较高，可用作羟基-L-脯氨酸生广囷O
[0007]本发明所提供的利用重组嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，具有重要的工业应用价值。
【发明内容】
[0008]针对生物合成法生产羟基-L-脯氨酸时，需外源添加L-脯氨酸导致生产成本较高的缺点，本发明的目的是选择高产L-脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium8061:03(^(1(^11；[111111)勵.45作为生产菌株进行菌株构造，获得重组的嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-轻基-L-脯氨酸。
[0009]本发明是一种通过选用高产L-脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌(Corynebacter iumacetoacidophilum)N0.45以达到高产反式-4-轻基-L-脯氨酸的生物合成方法。其特征是:选择高产L-脑氨酸的嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)N0.45作为生产菌株，具有多克隆位点、可存在于多种宿主菌的pkl9mobSacB作为表达载体进行菌株构造，使得生物体可以获得大量的L-脯氨酸，达到高产羟基-L-脯氨酸的目的。
[0010]本发明中的脯氨酸羟化酶基因(P4H)含有独立的高效启动子-色氨酸串联启动子(Ptrp2)，从已有的重组载体上酶切获得。
[0011 ] 作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pkl9mobsacB、pkl8mobsacB等。
[0012]作为宿主细胞，要能够表达目的基因，除了使用棒状杆菌属、大肠杆菌属、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株，也可以使用动物细胞作为宿主。
[0013]本发明可以应用于反式-4-羟脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。
[0014]作为微生物可以利用的氮源，可以是硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类或其他含氮化合物，还可以有玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆柏等有机氮源。
[0015]作为微生物可以利用的无机盐，有磷酸二氢钾、氯化镁、硫酸亚铁、氯化钙等。
[0016]重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37°C，培养时间12-72小时。
[0017]本发明的方法是通过重组嗜乙酸棒杆菌发酵反式-4-羟脯氨酸，具有重要的工业应用价值。
【附图说明】
[0018]图1是单一表达载体pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP的构建。
[0019]图2是含单一表达载体菌株的获得。
【具体实施方式】
[°02°] 一般性说明:【具体实施方式】中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工，每个操作完全按照试剂盒的说明。
[0021]种子培养基(％):葡萄糖3，牛肉膏1.2，蛋白胨1，尿素0.1，酵母膏0.5，他(:1 0.5，生物素200ug/L，pH 7.0-7.2。
[0022]Kan(Amp)抗性平板:I % (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母抽提物，I % (W/V)NaCl，1.5% (W/V)琼脂糖，硫酸卡那霉素(氨苄青霉素)50yg/mL。
[0023]5父1^1(电击缓冲液):0.51 KC1，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2o
[0024]反式-4-羟脯氨酸的定量测定:将发酵液离心后，取上清，稀释到2.5mL后加于1mL试管中，之后加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:将1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为:将50g柠檬酸，26.3g NaOH和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200mL水以及300mL正丙醇混合)，摇勾后在室温中放置20min，然后加入ImL显色剂(显色剂:称取I Og对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇)，摇匀后迅速将试管移至60°C水浴锅中，保温20min，再用冷水冷却，最后用紫外分光光度计在560nm波长处测定吸光值。
[0025]实施例1:含有H4P的重组质粒(PUC19-Ptrp2-HYP)的获得
[0026]取实验室保存的含有目的质粒的菌株活化，于37°C，220rpm培养12-16小时。取培养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
[0027]实施例2:含有H4P基因的表达载体pkl9mobsacB的获得
[0028]用EcoR1、BamHI两种酶分别双酶切处理PUC19-Ptrp2-HYP、pkl9mobsacB，酶切产物胶回收得到线性的Ptrp2-HYP以及pkl9mobsacB片段，用T4DNA连接酶将两者置于16°C连接过夜后，将1yL的连接液转入大肠杆菌JM109，挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行酶切验证，验证正确的重组质粒即为pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP。
[0029]实施例3:含有H4P基因的重组菌株(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)的获得
[0030]将pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP重组质粒转化嗜乙酸棒杆菌C.acetoacidophi IumN0.45,获得重组菌株C.acetoacidophiIum N0.45(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)。
[0031]实施例4:重组菌株的发酵实验
[0032]摇瓶培养:挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到种子培养基(含硫酸卡那霉素50yg/mL)中，30°C、220rpm培养12h后，按5%(V/V)接种量接入含有30mL发酵培养基【14%(W/V)葡萄糖，1.5%(W/V)氯化铵，2%(W/V)玉米浆，3%(W/V)谷氨酸钠，0.15%(W/V)磷酸氢二钾，100yg/mL生物素，100yg/mL硫胺素，pH 7.0?7.2】的250mL摇瓶中，在旋转式摇床中30°C、220rpm培养36h。取发酵液检测反式-4-羟脯氨酸浓度。反式-4-羟脯氨酸的测定方法详见实施方式一般性说明。发酵结果显不，C.acetoacidophiIum N0.45(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)的反式-4-羟脯氨酸初步发酵产量达到106mg/L。
【主权项】
1.一种利用重组嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中重组嗜乙酸棒杆菌携带的重组质粒是将具有催化脯氨酸生成反式-4-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(P4H)重组到质粒pklQmobsacB上，得到具有合成反式-4-羟脯氨酸生物活性的重组微生物。2.如权利要求1所述，具有合成反式-4羟脯氨酸生物活性是指，生物细胞具有可以利用外源添加或者自身积累的脯氨酸，在脯氨酸羟化酶、α-酮戊二酸和亚铁离子共同作用下，将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力。3.权利要求1所述的载体、多拷贝质粒包括但不局限于pkl9mobsacB，pkl8mobsacB，pET-28a、pUC19 等。4.反式-4-羟脯氨酸的生产方法，其特征是将权利要求1、2所述的重组微生物在培养基上培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在葡萄糖存在的条件下，于水性介质中将葡萄糖转化为L-脯氨酸，再从L-脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸，最后从该水性介质中提取生成的反式-4-羟脯氨酸。5.如权利要求1和2所述，生物细胞包括任何能够表达脯氨酸羟化酶，自主产生α-酮戊二酸，将脯氨酸转化为羟基-L-脯氨酸的有机体，包括嗜乙酸棒杆菌、大肠杆菌、酵母、动植物细胞等。
【专利摘要】本发明公开了一种利用重组嗜乙酸棒杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。该重组嗜乙酸棒杆菌携带的重组质粒具有催化脯氨酸生成反式-4-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(P4H)。在重组嗜乙酸棒杆菌细胞内，脯氨酸-4-羟化酶在α-酮戊二酸以及亚铁离子存在的情况下，可以将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸。本发明还公开了所述在嗜乙酸棒杆菌反式-4-羟基-L-脯氨酸生产中的应用。
【IPC分类】C12N15/63, C12P13/24
【公开号】CN105603017
【申请号】CN201610035787
【发明人】张震宇, 王晓姣, 姚动邦, 魏照辉, 黄建华
【申请人】江南大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月19日