一种间接制备d-异抗坏血酸钠的方法
【技术领域】
[0001]本发明生物化学分离合成技术领域，特别涉及一种间接制备D-异抗坏血酸钠的方法。
【背景技术】
[0002]D-异抗环血酸(Erythorbic acid, EA)，又名赤藻糖酸或阿拉伯抗坏血酸，是L-抗坏血酸钠的一种旋光异构体，简称异Vc13D-异抗环血酸及其钠盐(Sodium erythorbate ,EN)具有很强的还原性，防腐抗氧的效果大大优于维生素C，对热的稳定性也比维生素C强，而价格只有维生素C的1/2。异抗坏血酸及其钠盐是安全、有效的食品添加剂，广泛应用于各类食品中。异抗坏血酸钠为白色或微黄色针状晶体，无臭，味略咸，在空气中较稳定，遇光色渐变暗，在水中易溶，在甲醇、已醇中微溶解。D-异抗坏血酸钠的制备方法主要有间接发酵法、直接发酵法和酶法。目前工业生产上采用间接发酵法即发酵与合成相结合进行生产。
[0003]2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid, 2-KGA)是食品添加剂(抗氧化剂)D-异抗坏血酸及其钠盐工业化生产过程中的关键中间体。2-KGA分子式为C6HiqO7,分子量为19L2-KGA外观上为白色细微结晶体，稍带咸味，无嗅，易溶于水且水溶液略显酸性，具有旋光性，其比旋光度为[α]2?= -88° 2-KGA的产生菌分布较为广泛，多数菌株为野生型，分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)和醋酸杆菌属(Acetobacter)。
[0004]目前国内外2-KGA生产菌通常采用假单胞菌属的菌株，该种菌株的发酵液经过酯化等处理得到的D-异抗坏血酸钠得率和纯度较低。开发一种D-异抗坏血酸钠得率高且纯度高的方法意义重大。
[0005]申请公布号为“CN104830712 A”的中国发明专利“一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株”公开了采用粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY_136菌株发酵产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为N0.10548，保藏时间:2015年2月9日。
【发明内容】
[0006]为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种采用产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY_136菌株的发酵液制备D-异抗环血酸的方法。
[0007]本发明的技术方案为:
一种间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY-136菌株的发酵液为原料，经发酵液预处理、2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯化反应、转换反应得D-异抗坏血酸粗钠盐；再经精制纯化得D-异抗坏血酸钠产品；所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY_136菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No:10548,其保藏时间为:2015年2月9日。
[0008]作为优选方案，所述间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，具体步骤为:
1)菌种发酵
按照8-12%的接种量将所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY_136菌株的种子液接种到发酵培养基中，在29-31°C、400-600r/min条件下发酵培养30-40h，得到2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液；
2)发酵液预处理
所述2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液离心后所得清夜中加入浓硫酸，然后在50-95°C的水浴条件下，向酸化后的清夜中加入活性炭，搅拌脱色;脱色后滤除活性炭，所得滤液过阳离子交换树脂柱，由阳离子交换树脂柱除杂后收集的处理液减压蒸馏，得固形物含量为70-90%得2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液；
3)甲酯化反应
向所述2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入甲醇，并以硫酸作为催化剂，于60-100°C反应
5-10h，反应完毕，浓缩、4°C下结晶，抽滤并烘干得2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐；
4)转化反应
将所述2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐加入甲醇中溶解，然后加入甲醇-氢氧化钠混合液，在55-70 °C下，反应13-20min，然后于4°C下放置结晶，抽滤得D-异抗坏血酸粗钠盐；
5)D-异抗坏血酸钠的精制
所得D-异抗坏血酸粗钠盐溶于水中，加入活性炭和草酸，加热至50-70 °C，保温搅拌3-8min，然后趁热抽滤得滤液;所得滤液冷却、结晶、抽滤并用90-100%乙醇洗涤后干燥得D-异抗坏血酸钠产品。
[0009]作为优选方案，步骤I)中获得种子液所用的种子培养基组成为蛋白胨5g/L、氯化钠5 g/L、牛肉膏3 g/L，pH值为7.0;所述发酵培养基组成为葡萄糖180 8/1、玉米浆9.01 g/L、硫酸二氢钾I g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化猛0.037 g/L、硫酸亚铁0.036 g/L、碳酸|丐65 g/L0
[0010]作为优选方案，步骤2)中活性炭的加入量为固形物含量的5-15%，脱色时间至少为0.5h0
[0011]作为优选方案，步骤2)中，所述阳离子交换树脂柱为732#阳离子交换树脂柱，所述阳离子交换树脂柱高径比为9:1-10:1，流速每小时1-1.1倍柱体积。
[0012]作为优选方案，步骤3)中甲醇的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入5-1.5mL甲醇。
[0013]作为优选方案，步骤4)中，2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中甲醇的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入10-10.5mL甲醇；甲醇-氢氧化钠混合液的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入4-4.5mL甲醇-氢氧化钠混合液。
[0014]作为优选方案，步骤5)中，活性炭和草酸的加入量均为固形物含量的0.5%-0.7%。
[0015]本发明的有益效果:
本发明以粘质沙雷氏菌为生产菌种发酵得到2-酮基-D-葡萄糖酸钙，结合多种除杂方式，将处理液转化合成D-异抗坏血酸钠，得到的发酵液2-酮基-D-葡萄糖酸产量高、转化率高，D-异抗坏血酸钠粗品纯度高，易于精制，总收率得到提高，具有良好的推广应用前景。
【附图说明】
[0016]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0017]图1为本发明实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品；
图2为本发明实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图；
图3为标准D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图。
[0018]粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SDSPY_136菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏编号为N0.10548，保藏时间:2015年2月9日。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于此。
[0020]种子培养基组成为:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏3 8/1，？!1值为7.0。
[0021]发酵培养基组成为:葡萄糖1808凡、玉米浆9.01 g/L、硫酸二氢钾I g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化锰0.037 g/L、硫酸亚铁0.036 g/L、碳酸钙65 g/L。
[0022]实施例1
间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，具体步骤为:
I)菌种发酵
将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CGMCC N0.10548菌株移接斜面活化。
[0023]按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，500ml三角瓶装液量为50ml，121°(:蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，30 °C培养12小时，得种子液，取种子液置600nm测吸光值为0.262 ；
以5L发酵罐按3L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115 °C实罐灭菌20分钟，循环水冷却至30°C后接种培养好的种子液300 ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为185 g/L。
[0024]初始发酵罐参数设置为:搅拌转速为350r/min，通气量0.7?0.8Nm3/h，罐内压力0.065MPa。发酵过程中控制发酵温度30±0.2°C，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为35%。
[0025]发酵过程中每4小时取样，测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10 g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为36小时。
[0026]发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.02g/L、188.9g/L，葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为102.11%。
[0027]2)发酵液的预处理
发酵液离心后测定Ca2+含量为0.66mol/L，加入0.66mol/L的浓硫酸，使Ca2+转化为硫酸钙沉淀下来，离心后得到酸化清液2.7L;固形物含量19.2%，于80°C水浴条件下，加入占固形物含量5%的活性炭，不断搅拌，脱色0.5h，脱色后抽滤;滤液经732#阳离子交换树脂，流出液3.1L;将经柱子除杂收集到的处理液于55°C进行减压浓缩，浓缩至固形物含量为80%，共501.3g0
[0028]3)甲酯化反应
取100g2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液，加入500ml甲醇，以浓硫酸作催化剂，于80°C水浴下反应7h，并向反应器中补充甲醇。浓缩后于4°C放置，经抽滤后，用甲醇清洗，洗液并入清液中。沉淀于40°C烘干，即得甲酯盐64.12g。
[0029]4)转化反应
将60g甲酯盐加入到600ml甲醇溶液中，搅拌使其完全溶解，加入甲醇-NaOH溶液250ml，65°C水浴下反应17min，于4°C放置一段时间后抽滤，得粗钠盐50.82g，纯度为98.1%。其中，甲醇一NaOH溶液中甲醇与氢氧化钠的质量比为10:1。
[0030]5)D_异抗坏血酸钠精制
将50.5g粗钠盐溶于水中，加入0.3g草酸及0.3g活性炭，水浴保温至60 V，保温搅拌5min，趁热抽滤得滤液150ml。经冷却结晶、抽滤，95%乙醇洗涤晶