一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于动物疾病快速检测技术领域，设及一种用于NADC30-1化e PRRSV的PCR 检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（俗称猪蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratoiT syn化ome virus,PRRSV)引起的一种猪烈性传染病，临床 主要表现为母猪流产、死胎或者生长育肥各阶段猪群呼吸道症状。我国于1996年报道了该 病的发生，并分离出病毒;随着2006年猪的无名高热症暴发，给养猪业带来了巨大的经济损 失。
[0003] 当前，由于动物及其产品的不断输入，NADC30 PRRSV也在随着不断地分离到，与国 内高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)重组变异，演化为NADC30-1 ike PRRSV新 毒株，已经在我国河南、河北、山西、四川、广西、广东等地区流行，且呈现出进一步扩散和蔓 延趋势。NADC30-1 ike PRRSV与其他流行PRRSV最大区别在于化p2区域缺失了393个核巧酸。 由于NADC30-like PRRSV毒力变化快、不同类型毒株间临床症状接近，且易与其他病原混合 感染等原因，使得临床诊断困难；因此快速准确的鉴别检测NADC30-like PRRSV，制订合理 的预防控制措施，成为防控该病关键。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物，其特征 在于它的上游引物序列为:5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3， 下游引物序列为：5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3 所述的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒包括:HP-PRRSV，Classical-PRRSV，NADC30-like WRSV。
[0005] 本发明进一步公开了用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物、PCR Buffer、dNTPsjTaq酶、Marker及阳性和阴性标准 品，其引物序列为： 上游引物序列为(Nsp2-F) : 5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3， 下游引物序列为(Nsp2-R) : 5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3。
[0006] 本发明更进一步公开了采用NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒检测方法，主要 包括： (1) 提取待测样品的核酸； (2) W特异性引物对检测样品进行PCR扩增反应； (3) 扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳； (4) 观察电泳检测图，根据特异性目的条带判定结果。
[0007] 电泳图中如出现6286口特异性条带，表明该样品感染魁0〔30-^46口1?1?5￥，如果出 现93化P特异性条带，表明该样品感染HP-PRRSV。如果出现102化P特异性条带，表明该样品 感染Classical-PRRSV;如果出现多种特异条带，表明该样品混合感染相应类型病毒。
[0008] 本发明更进一步公开了用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物的 PCR试剂盒在进行鉴别NADC30-1 ike PRRSV病毒方面的应用。
[0009] 实验的结果表明：本发明设及的引物不仅能够检测NADC30-like PRRSV，而且能够 同时检测HP-PRRSV，Class i cal-PRRSV，另外，本发明还能够检测2类及W上PRRSV病毒混合 感染(具体例子见图3临床样品应用检测，其中17号就为NADC30-PRRSV和HP-PRRSV混合感 染)。
[0010] 本发明更力愧细的描述如下； 一、材料与方法 1、毒株与临床样品 PRRSV NADC30-1 ike (TJnh株）由天津市畜牧兽医研究所分离鉴定并保存;HP-PRRSV (TJM-F92株)购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；Classical-PRRSV(VR2332株)购自 勃林格殷格翰药业有限公司。
[0011] 样品为疑似PRRSV感染病猪的肺脏及淋己结，均采自于天津及周边发病猪场。
[001引2、阳性标准品 WPRRSV的化p2基因（NCBI登录号为JN654459.1)为模板，WNsp2-F与化p2-R为引物进 行扩增反应，将扩增反应获得的特异性扩增片段，分别连接到T克隆载体上，构成的重组质 粒。
[001引3、阴性标准品 灭菌生理盐水即为本发明试剂盒的阴性标准品。
[0014] 4、RNA 提取 PRRSV NADC30-like (TJnh株）、HP-PRRSV(TJM-F92株）、Classical-PRRSV(VR2332株） 及样品按照化izol reagent说明书进行操作提取RNA，具体步骤为:新鲜样品20化L，分别加 入Trizol Reagent 600化，振荡混匀，室溫作用5 min,后加入200化氯仿，振荡混匀，室溫 作用5 miru4 °C、12 000 r/min离屯、10 min,取上清至新的1.5 mL离屯、管中，加等体积异 丙醇，颠倒混匀，室溫放置15 HiiruA °C、12 000 r/min离屯、10 min，弃上清;500化75% 乙醇洗涂。4 °C，12 000 r/min离屯、10 min,自然干燥，加20化DEPC水溶解。
[001 引 5、cDNA 合成 按反转录试剂盒说明书进行反转录，其反应体系为（总体积20化）：SXbuffer化L， Random primer ljiL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2]iL，MgC12 化L'RNase Inhibito;r(40 U/uL) 0.5 化，M-MuLV Reverse Transc;rip1:ase巧 U/]iL)0.5 jiL，RNA模板 10 化。反应条件为：30 °C 10 min，42 °C解育 I h，95 °C 5 min，4 °C保存备用。
[0016] 6、引物合成 通过对比Genebank提供的NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV、Classical-PRRSV 化p2基 因序列，设计并合成1对引物，上游（。）：5-416門616(：1'1'(：圳6666門6-3，下游（1〇:5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3，NADC30-1 ike PRRSV扩增片段长度628bp，HP-PRRSV扩增片段长 度93化p，Classical-PRRSV扩增片段长度102化P。引物由上海生物工程技术有限公司合成。
[0017] 7、RT-PCR 反应体系 PCR反应体系为20 yL:10XPCR buffer 2 化，dNTPs(2.5 mmol/L)2 化，Mgcl2 I 化， 上、下游引物各I化jTaq巧U/yUO.S化，cDNA模板5化，加去离子水至20化，混合均 匀，同时设立阴性和阳性对照。PCR反应条件:95 °CSmin; 94°C40s，56 °C 30s，72 °C Imin，共30 个循环;最后72 °C延伸lOmin。反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的大小 情况判断结果。
[001引 8、RT-PCR产物鉴定 PCR产物琼脂糖电泳，切胶回收试剂盒纯化，克隆到PMD18-T载体，然后转化JM109感受 态细胞，挑取阳性菌落，摇菌、PCR鉴定后送上海生物工程有限公司测序。
[0019] 9、特异性试验 分别 Wprrsv NADC30-like (TJnh株）、册-PRRSV(TJM-F92株）、Classical-PRRSV (VR2332株)及〔5。￥、？3￥、？(：￥2、？?￥、巧￥、8￥0￥、51￥核酸为模板，进行同等条件下？〇?扩增，^ 检测引物和检测方法的特异性。
[0020] 10、敏感性试验 将提取的PRRSV NADC30-like (TJnh株）、册-PRRSV(TJM-F92株）Xlassical-PRRSV (VR2332株)的RNA用核酸蛋白分析仪测定其核酸浓度，然后进行10倍系列稀释，用本发明建 立的RT-PCR检测方法检测其敏感性。
[0021 ] 11、重复性试验 取PRRSV NADC30-like (TJnh株）、HP-PRRSV(TJM-F92株）、Classical-PRRSV(VR2332 株)作为模板，用本发明的鉴别检测方法进行RT-PCR反应，重复3次，检测其重复性。
[0022] 12、临床样品应用检测 对2014-2016年送检的342份PRRSV疑似样品用本发明的鉴别RT-PCR方法进行检测并重 复3次，同时用IDEXX的化ISA检测试剂盒进行对比检测，比较检测结果。
[0023] 二、结果与分析 URT-PCR产物鉴定结果 测序结果经Blast软件对比分析表明，本发明扩增PRRSV NADC30-1化e (TJnh株）的目 的片段序列与NADC30株及MN184C株的Nsp2区域序列同源性为100%;扩增HP-PRRSV(TJM-F92株）的目的片段序列与TJM-F92株的化p2区域序列同源性为100%;扩增Classical-PRRSV (VR2332株）的目的片段序列与VR2332株的化p2区域序列同源性为100%。
[0024] 2、特异性试验结果 用该检测方法对PRRSV NADC30-like(TJnh株）、HP-PRRSV(TJM-F92株XClassical-PRRSV(VR2332株）及〔5。￥、？3￥、？〇^2、？?￥、巧￥、8￥0￥、51￥进行特异性检测，结果显示？1?尺5￥ NADC30-like(TJnh株）可扩增出628bp条带，册-PRRSV(TJM-F92株）可扩增出93化P条带， Classical-PRRSV(VR2332株)可扩增出102化P条带，其余均未扩增出条带（图1)，说明该检 测方法具有良好的特异性。
[0025] 3、敏感性试验结果 在本发明的RT-PCR反应条件下，对 PRRSV NADC30-like (TJnh株）、HP-PRRSV(TJM-F92 株）、Classical-PRRSV(VR2332株）的最小 DNA 检出量分别为 2.1pg、3.4pg、4.5pg(图