一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 化学发光免疫分析是一种应用广泛的免疫分析方法，常见的化学发光底物液由A 液氧化剂和B液发光剂组成，使用时A液和B液混合，混合步骤繁琐，混合不容易均匀而且使 用也不太方便，目前市面上的化学发光液，多采用这种方式来配制，往往步骤繁琐，而且由 于增强剂效果有限，灵敏度也较低。CN200410005756.1公开了采用对碘苯酚作为增强剂的 底物液，但仅以对碘苯酚为增强剂时，其背景发光值高，灵敏度低，发光强度较低。 CN200510071823.4公开了采用对碘苯酚和四苯硼钠作为增强剂的底物液，该配方同仅采用 对碘苯酚作为增强剂的配方相比，增强发光的效果有限，灵敏度仍然较低。 CN200810105504.4公开了采用4-羟基联苯和4-碘代苯基硼酸作为增强剂的底物液，该配方 同采用对碘苯酚和四苯硼钠作为增强剂的配方相比，增强发光的效果有限，灵敏度仍然较 低。
[0003] 降钙素原(PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质。正常代谢时，甲状腺C细胞分泌 并产生有激素活性的降钙素。PCT在健康个体中的浓度非常低(〈0. lng/ml)，当严重细菌、真 菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和 病毒感染时PCT不会升高，局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。
[0004] 辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用在于分解过氧化氢产生氧负离子，氧负离子氧 化鲁米诺化学发光。其作用机理在于，首先辣根过氧化物酶和过氧化氢反应生成水和氧化 态辣根过氧化物酶I，氧化态辣根过氧化物酶I和鲁米诺反应生成氧化态辣根过氧化物酶II 和氧化态鲁米诺中间体，氧化态辣根过氧化物酶Π 进一步和鲁米诺反应生成氧化态鲁米诺 中间体和辣根过氧化物酶，氧化态鲁米诺中间体水解释放出光子。如果增强剂可以更高效 快速的和HRP I和HRP II反应生成增强剂自由基，增强剂自由基就可以更快的和鲁米诺反 应生成鲁米诺自由基，就可以显著的增强其化学发光。研究新型的增强剂是提高化学发光 检测灵敏度的关键，也是化学发光中最前沿的研究方向。
[0005] 目前市面上的降钙素原检测试剂盒，采用胶体金检测、胶乳比浊法和ELISA方法 的，这几种方法灵敏度较低，不能满足微量检测的需要;采用化学发光方法的，但目前的化 学发光方法多采用双试剂和灵敏度较低的发光底物液，背景值高，灵敏度也不高。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种单一的化学发光底物液及利用此化学发光 底物液的灵敏度高的降钙素原检测试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种化学发光底物液，由以下组分组成:0.8~1.5g/L鲁米诺或其衍生物，0.05~ 0.6g/L 2-氨基-4-硝基苯酚，0.01~0.05mg/L 9,9-二己基-2,7-二溴代芴，3~6g/L聚乙烯 醇，6~20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3~4.5g/L聚乙二醇600，100~300万单位/L硫酸庆大霉素， 0.1 ~1. Og/L过氧化脲，pH9.0的0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液。
[0009] 进一步地，由以下组分组成：1.2g/L鲁米诺或其衍生物，0.3g/L 2-氨基-4-硝基苯 酚，0.04mg/L 9，9-二己基-2，7-二溴代芴，5g/L聚乙烯醇，12g/L聚乙烯吡咯烷酮，4.2g/L聚 乙二醇600，250万单位/L硫酸庆大霉素，lg/L过氧化脲，pH9.0的0. lmol/L的Tris-HCl缓冲 液。
[0010] -种降钙素原的化学发光检测试剂盒，包括:亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素化 抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品，上 述的化学发光底物液。
[0011] 进一步地，所述生物素化抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为：琥珀酰生物素和 抗降钙素原单克隆抗体上的氨基反应。
[0012] 进一步地，所述辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为:利用 NaI〇4溶液氧化HRP，得到醛化HRP，调解醛化HRP的pH至9.0~9.5，加入抗降钙素原抗体，搅 拌2小时;最后利用NaBH4溶液还原得到。
[0013] 本发明提供的一种化学发光底物液，是一种含有增强剂的单一试剂，既能够实现 HRP酶催化化学发光的反应，又能够有效提高发光强度和减少发光背景，实现高灵敏度检 测。将此化学发光底物液用于降钙素原检测试剂盒，采用单克隆抗体结合方式和HRP酶催化 的化学发光反应来获得检测结果，灵敏度大大提高，性能优于市面上的检测试剂盒。
【具体实施方式】
[0014] 本发明实施例提供一种化学发光底物液，按照下列组分制成:0.8~1.5g/L鲁米诺 或其衍生物，0.05~0.6g/L 2-氨基-4-硝基苯酚，0.01~0.05mg/L 9,9_二己基-2,7-二溴 代芴，3~6g/L聚乙烯醇，6~20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3~4.5g/L聚乙二醇600，100~300万单 位/L硫酸庆大霉素，0.1~1. Og/L过氧化脲，pH9.0的0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液。
[0015] 本发明实施例还提供一种降钙素原的化学发光检测试剂盒，包括:亲和素偶联的 纳米磁粒子，生物素化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗 体，降钙素原标准品和上述的化学发光底物液。
[0016] 其中，鲁米诺或其衍生物是发光剂，使用HRP酶做为催化剂，是一种使用范围最广 的发光剂，特点是HRP标记方法简单，发光时间长，发光稳定，背景值低;2-氨基-4-硝基苯酚 和9，9-二己基-2，7-二溴代芴是发光增强剂，特点是对于HRP催化鲁米诺发光的过程有很强 的发光增强作用，效果明显好于市面上的发光增强剂;聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二 醇是稳定剂，主要是稳定鲁米诺或其衍生物和氧化剂，防止在放置时产生反应，降低反应背 景;硫酸庆大霉素是防腐剂，在反应液中起稳定防腐作用;过氧化脲是氧化剂，在化学发光 反应中起到氧化鲁米诺或其衍生物，生成发光中间体的作用。
[0017] 实施例1 一种化学发光底物液
[0018] 实施例1提供一种化学发光底物液的制备方法，按照下列组分重量称取：
[0020] 以PH9.0的O.lmol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，定容到1L即可。
[0021 ]本发明化学发光底物液和进口化学发光底物液(Thermo公司最高灵敏度的Super Signal West Femto底物液）以及几种常见的化学发光底物液对比：以50ul Ing/mL辣根过 氧化物酶为样品，以去离子水作为空白对照，分别加入l〇〇uL本发明的化学发光液和Thermo 公司化学发光底物液以及含有几种常见增强剂的化学发光底物液，在化学发光检测仪上测 量化学发光信号。由表1结果可知，本发明的本底更低，灵敏度更高。对碘苯酚浓度〇. 36mM， 对羟基肉桂酸0.18μΜ，6羟基苯并噻唑5mM，4苯硼钠浓度为40mM，其余成分和本发明除2-氨 基-4-硝基苯酚和9，9-二己基-2，7-二溴代芴以外的相同。
[0022] 表1本发明化学发光底物液和进口化学发光底物液对比
[0023]
[0024]
[0025] 实施例2-种降钙素原检测试剂盒
[0026] 实施例2提供一种降钙素原检测试剂盒，包括:亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素 化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品， 实施例1的化学发光底物液。
[0027](一)制备方法 [0028] 1、降钙素原标准品
[0029] PCT纯品为PCT重组抗原，由武汉华美生