人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)又称黑节草，为兰科植物石斛属多年生草本植物。铁皮石斛是石斛中的极品，是著名的观赏兼药用兰花，铁皮石斛花朵也是市场上奇货可居的具有保健作用的名贵花茶原材料。然而在自然环境下，由于其对生境条件要求苛刻，铁皮石斛难开花、开花周期长、花量少，成为铁皮石斛花茶和花卉产业开发的瓶颈难题。因此，人工诱导铁皮石斛植株峰量开花对铁皮石斛花茶和花卉产业有着重要的商业价值，同时对研究铁皮石斛开花机理也有重要的意义。而现有的应用生物技术对诱导铁皮石斛开花的技术体系，虽可获得一定的开花诱导率，但有毒物质残留、成本高等问题大大限制了其市场推广价值。
[0003]如中国专利CN102577963B公开的一种诱导铁皮石斛开花的方法，包括以下步骤:采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎为试验材料，进行壮苗培养50?80d，再经过诱导开花阶段I一诱导开花阶段II一诱导开花阶段I的交替培养诱导后，进入开花培养阶段。在诱导开花阶段I中，培养基I为:1/2MS基本培养基+PP3330.50-1.50mg/L+ABA0.5-1.0mg/L，使用了 PP333作为植物生长调节剂。又如中国专利CN103210842B公开的一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，采用铁皮石斛茎段或铁皮石斛蒴果(铁皮石斛蒴果为合生心皮的复雌蕊发育成的果实，子房I室或多室，每室有多粒铁皮石斛种子)作为外植体进行诱导培养，再经原球茎增殖培养、原球茎生根培养、生根苗诱导开花培养及授粉过程及结实培养后，形成试管花及试管果实。在生根苗诱导开花培养时，将生根苗接种于下列诱导开花培养基中:MS+白糖30?60g/L+琼脂粉5.5?I lg/L+土豆30?50g/L+BA0.2-0.6mg/L+NAA0.1-0.9mg/L+PPP3330.3-0.8mg/L+Spml.0-6.0mmol/L+ZTl.5?6mg/L，其中也使用到了PP333JP333又叫多效唑，是一种植物生长调节剂，具有延缓植物生长，抑制茎杆伸长，缩短节间、促进植物分蘖、增加植物抗逆性能，提高产量等效果。但多效唑在植物中代谢慢，易产生残留超标的问题，且它对人体和环境的危害，目前已经被证实。因而食用多效唑诱导的花茶，易让人们产生安全性的焦虑。
[0004]有鉴于此，现有技术需要提供一种新的人工诱导铁皮石斛在开花的方法，使铁皮石斛的开花率提高，但又不产生药物残留的问题。
【发明内容】
[0005]本发明意在提供一种铁皮石斛在组培瓶内开花的方法，以解决现有技术的铁皮石斛开花率低、有害化合物残留的问题。
[0006]本发明中一种人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法，包括以下步骤:
步骤I):外植体的灭菌消毒:用无菌水将铁皮石斛蒴果表面的脏物冲洗干净，将铁皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再放入0.1%的升萊溶液中浸15min后，用无菌水冲洗4?5次，每次冲洗5min，备用；
步骤2):无菌萌发及幼苗生长:用无菌滤纸擦干蒴果表面水后，切开蒴果，将种子取出接种于萌发培养基中，萌发培养基为1/2MS固体培养基添加0.2?1.0mg/L萘乙酸、6.5?8.5g/L琼脂、15?30g/L蔗糖;接种后摇动，使种子均匀散布于培养基中，封口，将接种后的组培瓶移入培养室，培养温度22?28 °C，光强1200?20001x、相对湿度65?80%、每天光照11?16h，5?8d后种子开始萌发，30?45d后长成2?3cm的幼苗；
步骤3):生根壮苗培养:将步骤2)中的幼苗转接至生根壮苗培养基中；壮苗培养基为I/2MS固体培养基添加3.5?4.5mg/L萘乙酸、O?10% 土豆、6.5?8.5g/L琼脂、15?30g/L鹿糖；在温度22?28°C，光强1200?20001x、相对湿度65?80%、光照14?16h/d，60?80d后长成成苗；
步骤4):诱导开花:将步骤3)中的成苗转接至开花培养基中，开花培养基为1/2MS固体培养基添加0.8?2.0mg/L萘乙酸、5?10%椰汁、O?10%土豆、O?10%香蕉、6.5?8.5g/L琼月旨、15?30g//L蔗糖；在温度25?30°C，光强1500?25001x、相对湿度65?80%、光照14?16h/d ；诱导35?50d后得到开花苗；
步骤5):采花、继代培养:把步骤4)中的开花苗取出，夹住花托，将花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的开花培养基中进行继续培养，诱导分蘖开花;同样在温度25?30°C，光强1500?25001x、相对湿度65?80%、光照14?16h/d。
[0007]本发明的有益效果:本发明诱导铁皮石斛开花率高，能缓解当前社会对铁皮石斛花茶、铁皮石斛花卉或者鲜花和带花植株的迫切需求，并提供了一种新的安全无害的技术方法，本发明在营养条件、温度、光照和水汽等可控环境下培养出无毒、无害的鲜花，不使用对人体或环境有害的化学成分，并在人工条件下，125?175d可采收铁皮石斛花，与在自然条件下生长相比周期更短、产量更高、更经济、更能满足人们的迫切需求，对缓解铁皮石斛花的市场供需矛盾有积极意义。
[0008]作为优选的，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)和步骤5)均在超净工作台上进行。铁皮石斛在生长周期内，对环境的敏感度较高，易被外部环境所感染，出现不可控的因素，进而使诱导成功率降低，因此必须在超净工作台上进行。
[0009]作为优选的，所述铁皮石斛蒴果为成熟未开裂前采收的铁皮石斛蒴果。优点在于:
(I)有利于铁皮石斛蒴果的密封保存及运输，(2)减少铁皮石斛种子受污染的几率，(3)在进行铁皮石斛蒴果消毒灭菌时防止石斛种子接触酒精、升汞等对种子有毒性的液体，提高种子的发芽率。
[0010]作为优选的，作为本发明的一个应用，将步骤5)中已开花的植株炼苗后移栽，制作成观赏性花卉或盆景。
【附图说明】
[0011]图1为本发明人工诱导铁皮石斛在组培瓶内的开花情况示意图；
图2为本发明诱导出的正在开花的植株形态图。
【具体实施方式】
[0012]下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
实施例1:人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法，按照以下步骤进行:
步骤I):外植体的灭菌消毒:a、选择外植体:本实施例是从铁皮石斛种植基地购买的成熟未裂开的蒴果，选用其中颗粒饱满，表面无受损、未裂开的蒴果的种子为外植体；
b、外植体的灭菌消毒:在消毒后的超净工作台上进行，用无菌水将铁皮石斛蒴果表面的脏物冲洗干净，将铁皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再用0.1%的升汞溶液中浸15min后，用无菌水冲洗4?5次，每次冲洗5min，备用。
[0013]步骤2):无菌萌发及幼苗生长:用无菌滤纸擦干蒴果表面水后，在无菌环境下，用解剖刀切开蒴果，用镊子将种子取出接种于已分装好的萌发培养基中，接种后稍加摇动，使种子均匀散布于培养基中，封口，将接种后的组培瓶移入培养室，培养温度22?28°C，光强1200?20001x、相对湿度65?80%、每天光照11?16h，5?8天后种子开始萌发，45天后长成2?3cm的幼苗。
[0014]步骤3):无菌苗生根壮苗培养:在消毒后的超净工作台上进行，将幼苗继代至壮苗培养基中；壮苗培养基为1/2MS培养基添加3.5?4.5mg/L萘乙酸、8?10% 土豆、15?30g/L蔗糖、6.5?8.5g/L琼脂;培养条件:温度22°C?28°C，光强1200?20001x、相对湿度65?80%、每天光照14?16h，60?80d后长成成苗。
[0015]步骤4):诱导开花:将步骤3)中的成苗转