雪菊提取物及雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及雪菊的新用途，特别是雪菊提取物的新用途，即在制备治疗肝纤维化 药物或者功能食品方面的新用途。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化由多种致病因子引发的慢性肝损伤导致，包括慢性病毒性肝炎、酒精毒 性、自身免疫性疾病及遗传性代谢紊乱，其引起肝内纤维结缔组织异常增生，细胞外基质过 度沉淀。肝纤维化的主要效应细胞是肝星状细胞hepatic stellate cells ,HSCs)。生理情 况下，HSCs位于肝窦与肝窦壁之间的Disse间隙内，具有存储维生素A等功能。然而，肝脏受 损后HSCs被激活，转化成为具有收缩功能的肌纤维母细胞，分泌平滑肌α肌动蛋白（a-SMA) 和I型胶原，合成大量的细胞外基质，促进肝纤维化的形成。
[0003] NF-KB是炎症应答的主要介导者，NF-KB信号通路对于肝星状细胞的存活和肝脏内 环境的自我平衡至关重要。NF-κΒ信号活化可以促进HSCs增殖，产生分泌平滑肌α肌动蛋白 (α-SMA)和I型胶原，合成大量的细胞外基质，促进肝纤维化的形成。抑制NF-kB活化可介导 HSCs凋亡，抑制诸如α肌动蛋白（α-SMA)和I型胶原产生，从而阻断肝纤维化的发展进程。因 此，抑制NF-κΒ信号通路可能会作为一个潜在的肝纤维化治疗手段。
[0004] 雪菊系菊科金鸡菊属植物，主要产地为新疆昆仑山，是一种珍贵药食两用植物。雪 菊含有300多种天然成分，包括黄酮、维生素、氨基酸、多糖、有机酸、萜烯类等。现代药理学 研究发现，雪菊是一种很强的抗氧化植物，其生物黄酮、萜类物质等成分可有效地清除体内 的氧自由基，防止细胞变性衰老以及恶性转化，对于调节血压，降低血脂、预防糖尿病、肿瘤 等疾病有积极的保健作用。
[0005] "新疆昆仑雪菊水提液对大鼠血脂的影响"《新疆农业大学学报》（2013,36:366-70)崔康康等人研究报道昆仑雪菊水提液可以显著下降SD大鼠血脂水平。
[0006] "Chemical and nutraceutical properties of Coreopsis tinctoria" 《Journal of Functional Foods》（2015,13: ll_20)LiminGuo等人报道当前雪菊的医学效 应主要有抗衰老、降低血糖改善糖耐受、降血脂、降血压、抗氧化、抗凝等。
[0007] 目前未检索到雪菊、雪菊提取物可用于治疗肝纤维化的文献报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物方面的新用途。
[0009] 本发明的另一目的是提供雪菊提取物及其雪菊总黄酮作为NF-κΒ信号通路抑制剂 在制备治疗肝纤维化药物方面的新用途。
[0010] 本发明的目的是通过下列的技术方案实现的：
[0011] 本发明原料来源：
[0012] 雪菊coreopsis tinctoria:系菊科金鸡菊属植物，又名两色金鸡菊，原产美国中 西部地区，主要分布在中国新疆昆仑山北麓海拔3000米雪线的部分地区。一年生草本植物， 有降血压、降血脂和降血糖之功效。
[0013] 本发明通过体外实验，给予人肝星状细胞LX-2雪菊总黄酮后，抑制LX-2增殖，促进 LX-2凋亡，α-SMA和I型胶原表达量随着药物剂量增加逐渐减少。同时，雪菊总黄酮降低NF-κ B的DNA结合活性，从而抑制NF-kB信号驱动的下游基因表达，导致促凋亡基因 mRNA表达增多 (如:BCL-Xs，RIPl)，抗凋亡基因 mRNA表达减少(如:A20，FLIP)，从而造成肝星状细胞LX-2凋 亡。
[0014] 本发明通过体内试验，分别给予经CCl4诱导的肝纤维化大鼠雪菊总黄酮以及雪菊 提取物处理，发现大鼠血清AST和ALT水平显著降低，a-SMA和ECM表达减少，肝组织细胞匀浆 经检测其NF-kB的DNA结合活性显著下降，表明雪菊提取物及其雪菊总黄酮具有抗大鼠肝纤 维化，保护肝细胞，改善肝功能的功效。
[0015] 本发明不仅证实雪菊提取物及其雪菊总黄酮具有对肝纤维化大鼠肝保护作用，而 且证明其作用机理与雪菊提取物及其雪菊总黄酮可以抑制炎性转录因子NF-kB生物学活 性，从而实现肝纤维化治疗的机理。
[0016] 雪菊作为一种传统的药食两用植物，临床应用和日常保健的安全性非常高，在治 疗肝纤维化药物治疗中不失为一种好的手段，拓宽了治疗肝纤维化的新方法，而且雪菊由 于具有多重健康效应，为患者提供了非常有益的治疗选择。
[0017] 因此，本发明提供雪菊、雪菊提取物、雪菊总黄酮能够用于治疗肝纤维化药物方面 的新用途。
[0018] 本发明还公开了雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物方面的应用，所述雪菊提取 物的制备包括以下步骤：
[0019] 将雪菊花干燥，采用PULVERISETTE 14在15000rpm转速条件下粉碎后，沸水浴1小 时，离心，取上清，通过直径0.22微米滤膜过滤，收集滤液。然后再向沸水浴锅内添加沸水， 重复上述步骤2次，将3次滤液合并后置于旋转蒸发仪浓缩成水浸液，浓缩，干燥，得到雪菊 提取物。
[0020] 雪菊中含有绿原酸、邻苯二酚等具有邻苯二羟基结构，碱性环境下与铝离子形成 络合物，可能会对黄酮的测定造成干扰。芦丁是一种结构与功能较清楚的黄酮类化合物槲 皮素的糖苷，以芦丁为标准品，采用AlCl 3法测得雪菊总黄酮得率为18.47%
[0021] 本发明还公开了雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物方面的应用，所述雪菊总黄 酮的制备包括以下步骤：
[0022] 将雪菊花干燥，采用PULVERISETTE 14在15000rpm转速条件下后粉碎，沸水浴1小 时，离心，取上清，通过直径0.22微米滤膜过滤，收集滤液。然后再向沸水浴锅内添加沸水， 重复上述步骤2次，将3次滤液合并后置于旋转蒸发仪浓缩成水浸液，浓缩，干燥，获得雪菊 提取物。将该提取物减压浓缩至最小体积后用石油醚脱脂，再用正丁醇萃取，减压回收正丁 醇，水层减压浓缩，真空干燥，得到雪菊总黄酮。
[0023]同样地以芦丁为对照品，采用AlCl3法测得雪菊总黄酮得率为17.38%。
[0024]雪菊总黄酮给药方式为口服，剂量为20mg/kg。
【附图说明】
[0025]图1是本发明实验中雪菊总黄酮对LX-2细胞的增殖抑制率；
[0026]图2A-1是本发明实验中雪菊总黄酮诱导1X-2细胞凋亡的一次流式细胞术检测代 表性结果；
[0027]图2A-2是本发明实验中雪菊总黄酮诱导1X-2细胞凋亡的三次独立流式细胞术检 测实验的统计结果；
[0028]图2B是本发明实验中对照组，给予雪菊黄酮5mg/L处理LX-2细胞凋亡蛋白PARP检 测；
[0029]图3是本发明实验中雪菊总黄酮下调LX-2细胞纤维化蛋白α-SMA和ECM(type I collagen)表达；
[0030]图4是本发明实验中雪菊总黄酮抑制LX-2细胞NF-KB的DNA结合活性ELISA分析； [0031 ] 图5A-1、5A-2、5A-3分别是促凋亡基因FAS、BCL-Xs和RIPlmRNA表达上调；
[0032] 图5B-1、5B-2、5B-3分别是抗凋亡A20，BCL-Xl和FLIP基因mRNA表达上调；
[0033]图5C-1是雪菊总黄酮逆转TNFa诱发的LX-2细胞BCL-XL表达上调（图5C(D)，
[0034] 图5C-2是雪菊总黄酮逆转TNFa促进LX-2细胞促凋亡FAS基因表达(图5C②）；
[0035] 图6是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤 维化标记物a_SMA检测结果;ECM(type I collagen)、NF_icB的DNA结合活性；
[0036] 图7是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤 维化标记物ECM(type I collagen)检测结果;NF-κΒ的DNA结合活性；
[0037] 图8是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤 维化标记物NF-kB的DNA结合活性检测结果。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0039 ]本发明试验采用的试剂和原料：
[0040] RPMI1640培养基+10%胎牛血清;Annexin V凋亡检测试剂盒和PI荧光染料(美国 BD公司产品）；NF-kB的DNA结合活性检测试剂盒(美国Active Motif公司产品）；3-(4,5_二 甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自碧云天生物试剂公司）；RT-PCR引物均由上 海生工公司合成;ECM，α-SMA，PARP抗体均为Santa-Cruz公司产品。
[0041 ]实施例1细胞活性试验
[0042] 取对数生长期细胞(细胞浓度为7 X 103/ml)，以每孔100μΙ接种于96孔板，于37°C、 饱和湿度、5 % C02的培养箱中培养。细胞贴壁后，换成含雪菊总黄酮终浓度分别为0、2.5、5、 7.5、10、15、20、30mg/L的培养基继续培养，每一个浓度设6个复孔，培养24h后，每孔加入 ΜΤΤ20μ1 (以I3BS配成5mg/ml)，继续培养4h后，每孔再加入DMS0150yl，震荡IOmin。在酶联免 疫检测仪上460nm波长测定吸光度值。按公式:细胞生长抑制率=(空白组-雪菊总黄酮组/D 空白组）X 100%，计算雪菊总黄酮对LX-2细胞的生长抑制率。
[0043]结果显示，雪菊总黄酮能够剂量依赖性抑制LX-2细胞增殖，且其IC50值为10mg/L (如图1所示）。
[0044] 实施例2细胞凋亡实验
[0045] 以每孔IX 106个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，给予不同浓度的雪菊总黄酮， 孵育24h，使用美国BD公司FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒，根据说明书给予LX-2细胞 FITC-AnnexinV和PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集细胞，放入适量裂解液，冰上裂 解30min，4 °C 12000g离心15min，使用BCA法测定蛋白浓度。样品于10 % SDS-PAGE凝胶上进行 电泳，转移至IjPVDF膜，5%脱脂奶粉封闭Ih，以1:1000比例敷上PARP抗体，4°C过夜，次日洗膜 后加入相应二抗，37°C孵育lh，化学发光凝胶成像系统曝光。
[0046]结果显示:如图2A-1，为一次流式细胞术检测代表性结果，所示为不同给药浓度条 件下LX-2细胞凋亡比率(第Π，m，IV象限百分比之和），图2A-2为经三次独立流式细胞术检 测实验的统计结果。雪菊总黄酮5mg/L的凋亡率仅有5%，而10mg/L时凋亡率达到25%。进一 步，我们检测了凋亡蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)，其是一种DNA修复蛋白，切 割PARP通常被认为是凋亡指示者。如图2B所示，相较于对照组，给予雪菊黄酮5mg/L处理LX-2细胞时就出现了PARP切割条带，随着剂量增加，切割条带越来越明显。