一种水貂绿脓杆菌二价灭活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种水貂绿脓杆菌二价灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛 季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红 色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世 界各地均有发生，每年可造成养殖场20 %-40 %的死亡率，是危害毛皮动物养殖业的重要细 菌性传染病。
[0003] 该病病原为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿 假单胞菌（Pseudomonas aeruginolsa)，亦称为绿胺杆菌（Bacterium pyocyaneum)，为革兰 氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基 上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。绿脓杆 菌共有六3、(：、04、？、6、!1、1、6、1(^、~等14个血清型。我国各地水貂出血性肺炎的流行血 清型主要以G(6型）、B(2、5、16型)为主(括号内为对应的国际血清分型系统IATS)。
[0004] 水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿 奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需 要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物(JAMES E.PENNINGTON，1979)加类 毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大 量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分 的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。目前各国在水貂出血性肺炎的预防中多以菌 体灭活疫苗产品为主，将流行血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫苗，可有效预防同类 血清型菌株引起的该病。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水貂绿脓杆菌二价灭活疫苗，从而解决水貂绿脓杆菌灭 活疫苗研发中现有疫苗株免疫原性不强、各血清型之间免疫交叉保护力低的问题。
[0006] 本发明的一种二价水貂绿脓杆菌灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其中使用的 抗原为灭活的B型水紹绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginlsa)LN03株和灭活的G型水紹绿脓 杆菌（Pseudomonas aeruginlsa)SD17^；
[0007] 其中绿胺杆菌LN03株(Pseudomonas aeruginlsa LN03)，该菌株于2016年2月22 日 保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M2016068。
[0008] 绿胺杆菌SD17株(Pseudomonas aeruginlsa SD17)，该菌株于2016年2月22日保藏 在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO : M2016069。
[0009]上述的水貂绿脓杆菌是用甲醛进行灭活的；
[0010]优选佐剂为蜂胶佐剂或水佐剂。
[0011] 本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生 较强免疫力，接种貂群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防水貂出血性肺炎的流 行和传播，降低本病对毛皮动物养殖业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0012] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
[0013] 本发明具体实施例所使用的培养基如下：
[0014] 生产用培养基：
[0015] 十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)配制：称取4g NAC粉末加入IOOmL蒸馏水 中，充分混匀后，121°C灭菌15min，冷却至50 °C~60 °C时，倾倒平板备用。
[0016] 改良营养普通肉汤培养基(NB)配制:称取5g NB粉末加入IOOmL蒸馏水中，121°C灭 菌15min。临用前加入终浓度2%胎牛血清的营养肉汤培养基，混合均匀后配制而成。
[0017]发酵培养基配制：蛋白胨2%，牛肉膏0.6%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.5%，用去离子 水配成，配完调?11值7.4~7.6，1121€3〇1^11，灭菌后按照培养基的2%加入健康胎牛血清。 [0018] 实施例1:
[0019] 1.1绿脓杆菌菌株的分离纯化方法
[0020] 从疑似水貂出血性肺炎的某大型水貂养猪场选取发病水貂，无菌采集病貂的肺 脏、肝脏和心血划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)上，置于37°C培养箱培养 16h~18h，挑取圆形、光滑、湿润、扁平的菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进 行划线纯培养。
[0021] 将纯培养菌株分别划线接种于鲜血琼脂平板和NAC平板，37°C培养16h~18h，选取 在十六烷三甲基溴化铵培养基上产生绿色荧光色素，在血琼脂培养基上产生β溶血的小菌 落进行纯化培养。
[0022] 根据绿脓杆菌的生化鉴定试验要求进行鉴定，将进一步纯化培养的两株菌株，分 别进行绿脓色素培养基生长、氧化酶试验、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖分解试验、硝 酸盐还原试验、明胶液化试验、42°C生长试验等。结果均为表1所示。菌株根据其病貂的来源 地命名为LN03株和SD17株。
[0023]表1分离菌株生化试验结果
[0025] 1.2 16S rRNA基因序列测定与分析
[0026] 1 · 2 · 1 引物设计采用细菌的 16S rRNA通用引物F27(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和下游引物1?1492(5'1六066(^六〇：17617六06六〇'1'-3'）。引物送由上海生物工程技术服务 有限公司合成。引物由上海生物工程有限公司合成。
[0027] 1.2.2细菌0嫩模板的制备过夜培养绿脓杆菌，取11111菌液到1.5111找?管中，800(^/ min IOmin倒掉上清，沉淀用100μΙ蒸馏水悬浮，沸水煮沸15min，放在-20°C冰柜反复冻融3 次。5000r/min 1〇!1^11，收集上清即为细菌基因组0嫩。
[0028] 1.2.3PCR扩增PCR扩增体系总体积为25yL，10XEx Taq Buffer 2.5yL、dNTPs 2μ L、上下游引物（ΙΟμL?θΙ/L)各0.5yL、模板DNA lyL、Ex Taq DNA聚合酶0.25yL，ddH20 18·25μ Lc3PCR 扩增条件：941€5111丨11;94°(：1111丨11，53°(：1111丨11，72 1€2111丨11，循环30次；72°(：延伸1511^11。
[0029] 1.2.4凝胶电泳将PCR产物加上样缓冲液后，用1 %琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝 胶成像仪分析结果。经测定B型LN03株的16SrRNA基因片段大小为1524bp。用DNA快速回收试 剂盒回收PCR产物，-20 °C保存备用。
[0030] 1.2.5 16S rRNA扩增产物的克隆与测序将回收的PCR产物与PMD19-T在16°C连接 30min，转化DH5a感受态细菌，37°C过夜培养12h~16h。挑取平板上的单菌落于氨苄青霉素 抗性的LB液体培养基中37 °C过夜振荡培养，次日应用菌液PCR的方法扩增16SrRNA基因筛选 阳性克隆，鉴定为阳性的菌液提取质粒交由青岛华大基因科技股份有限公司测序。将序列 在GenBank中进行BLAST比对，与已发布的绿脓杆菌相应序列的同源性最高。
[0031] 1.3绿脓杆菌血清学鉴定
[0032]绿脓杆菌血清分型按日本生研株式会社铜绿假单胞菌标准阳性血清试剂盒附带 的说明书进行操作：
[0033] 1.3.1抗原的制备将被检菌株划线接种于NAC培养基上，置37°C培养24小时，再挑 取单个菌落接种于普通琼脂培养基上，37°C培养24小时。取单个菌落溶于IOOyL生理盐水， 置于EP管中，制成抗原备用。
[0034] 1.3.2玻板凝集反应取IOyL抗原与20yL血清在洁净的玻板上充分混合，同时取10μ L抗原与20yL生理盐水混合作为空白对照。结果判定：在Imin内，在透明的背景下观察到有 凝集块，空白对照为阴性的为凝集反应阳性。可见LN03株于B型血清与抗原之间出现明显的 凝集反应，故判定水貂绿脓杆菌LN03株为血清B型。
[0035] 1.3.3玻板凝集反应取IOyL抗原与20yL血清在洁净的玻板上充分混合，同时取10μ L抗原与20yL生理盐水混合作为空白对照。结果判定：在Imin内，在透明的背景下观察到有 凝集块，空白对照为阴性的为凝集反应阳性。可见SD17株于G型血清与抗原之间出现明显的 凝集反应，故判定水貂绿脓杆菌SDl 7株为血清G型。
[0036] 1.4动物攻毒试验
[0037] 1.4.1LN03株攻毒菌液