一类新型的诺西肽衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类新型的诺西肽衍生物1、2和3,这类化合物具有抑制细菌生长或杀 死细菌的作用。
【背景技术】
[0002] 近年来随着耐药菌感染的不断蔓延，现有的抗生素已经无法满足需求，因此开发 结构新颖、抗耐药菌活性强的新型抗生素迫在眉睫。
[0003]诺西肽（Nosiheptide)是一种由活跃链霉菌Streptomyces aetuosus ATCC25421、 Streptomyces sp.ATCC31463、Streptomyces glaucoghseus NRRL LL-BP189产生的具有抗 菌活性的硫肽类化合物。但是诺西肽的水溶性极大地限制了其应用。目前诺西肽仅用作为 一种新型的非吸收性动物饲料添加剂，适合于抑制肠道内革兰氏阳性细菌的生长。
[0004] 诺西肽是由nosM编码的前体肽经过翻译后修饰合成的。前体肽由37个氨基酸构成 的前导肽和13个氨基酸构成的核心肽构成。改变诺西肽核心肽基因将直接改变最终产物的 结构，这为产生新型的具有良好水溶性及抗菌活性的诺西肽衍生物打下了基础。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术不足，公开了一类新型的诺西肽衍生物，该类衍生物在上述 文献中未见报道，具有抗菌活性。
[0006] 本发明技术方案具体如下： 具有下式结构的诺西肽类衍生物或其药学上可接受的盐、酯、对映异构体、非对映异构 体或混合物：
其中，R为 CH3、CH2〇H或 CH(CH3)2。
[0007] 具体的，上述的诺西肽类衍生物优选如下结构的化合物： 化合物1
化合物3 d
本发明还提供了上述诺西肽类衍生物或其药学上可接受的盐、酯、对映异构体、非对映 异构体或混合物在制备抑菌或抗菌药物中的应用。
[0008] 上述诺西肽衍生物通过重组技术表达制备。通过定向改变诺西肽基因 nosM核心肽 序列得到。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明所述诺西肽衍生物化合物1的HPLC色谱图。
[0010] 图2为本发明所述诺西肽衍生物化合物1的高分辨质谱图。
[0011] 图3为本发明所述诺西肽衍生物化合物1的核磁共振氢谱图。
[0012] 图4为本发明所述诺西肽衍生物化合物1的核磁共振碳谱图。
[0013] 图5为本发明所述诺西肽衍生物化合物2的HPLC色谱图。
[0014] 图6为本发明所述诺西肽衍生物化合物2的高分辨质谱图。
[0015] 图7为本发明所述诺西肽衍生物化合物2的核磁共振氢谱图。
[0016] 图8为本发明所述诺西肽衍生物化合物2的核磁共振碳谱图。
[0017] 图9为本发明所述诺西肽衍生物化合物3的HPLC色谱图。
[0018] 图10为本发明所述诺西肽衍生物化合物3的高分辨质谱图。
[0019] 图11为本发明所述诺西肽衍生物化合物3的核磁共振氢谱图。
[0020] 图12为本发明所述诺西肽衍生物化合物3的核磁共振碳谱图。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0022] 以下实施例中所述斜面培养基、遗传操作培养基和发酵培养基配方如下： 斜面培养基:MS培养基 遗传操作培养基：ISP1培养基 发酵培养基：（g/L):酵母提取物3 . Og，玉米淀粉10 . Og，黄豆饼粉20 . Og，KN032 . Og， 〇&0)34.(^，恥(：14.(^，？!17.0，121。(：灭菌3〇11^11。
[0023] 工程菌株T3A，T3S和T3V的构建。根据GenBank公布的诺西肽生物合成基因簇序列， 设计上下游引物，以活跃链霉菌基因组为模板，通过定点突变PCR技术扩增出含nosM上下游 同源臂的下列nosM基因突变序列： (1) nosM基因第118位A碱基突变为G碱基的基因片段； (2) nosM基因第118位A碱基突变为T碱基的基因片段； (3) nosM基因第118位A碱基和119位的C碱基分别突变为G碱基和T碱基的基因片段。
[0024] 根据上述3种基因序列分别设计下述3组引物用于相应的基因扩增(下划线为限制 酶切位点），分别获得含目的突变基因的大小为2375bp的目的片段： (1)nosM-hF:5 '-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3' BamHI;(SEQ ID No:1) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3A-A:5 '-ACTCGCAGGTGGCGCACGAGGCCGACATGAC-3 '；（SEQ ID No:3) T3A-B:5 '-GTCATGTCGGCCTCGTGCGCCGCCTGCGAGT-3 '。（SEQ ID No:4)
[0025] (2)nosM-hF:5'-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3'BamHI;(SEQ ID No:l) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3S-A:5 '-CAGCACTCGCAGGTGGAGCACGAGGCCGACA-3 '；（SEQ ID No:5) T3S-B:5 '-TGTCGGCCTCGTGCTCCACCTGCGAGTGCTG-3 '。（SEQ ID No:6)
[0026] (3)nosM-hF:5'-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3'BamHI;(SEQ ID No:l) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3V-A:5 '-CAGCACTCGCAGGTGACGCACGAGGCCGACA-3 '；（SEQ ID No:7) T3V-B:5 '-TGTCGGCCTCGTGCGTCACCTGCGAGTGCTG-3 '。（SEQ ID No:8)
[0027] 分别将目的基因测序正确后双酶切后连接至温度敏感型质粒pKCl 139得到重组质 粒。然后再通过属间接合转移将重组质粒转入nosM缺失菌株L1000的活跃链霉菌，抗生素筛 选获得nosM突变菌株T3A、T3S和T3V，分别对应nosM基因第118位A碱基突变为G碱基(核心肽 第三位苏氨酸突变为丙氨酸）、T碱基(核心肽第三位苏氨酸突变为丝氨酸)和第118位A碱基 及119位的C碱基分别突变为G碱基和T碱基(核心肽第三位苏氨酸突变为缬氨酸)的的菌株。 [0028]工程菌的培养和发酵 将上述3种突变菌株T3A、T3S和T3V分别从冻干管中接种至MS培养基上，于30°C培养2天 后，转入装入经121°C高压灭菌在30min的ISP1培养基的三角瓶中，置于摇床进行培养，其 中，转速为220rpm，温度为30°C，培养时间为20h。然后，将种子液接种到已灭菌的发酵培养 基的三角瓶中，转种量为10 %，进行摇瓶发酵培养，转速为220rpm，温度为30°C，培养时间为 120h〇
[0029]表达产物的分离纯化 将上述三种突变菌株T3A、T3S和T3V经发酵后的发酵液，分别按照体积比1:1的比例加 入乙酸乙酯萃取4-8h，搅拌转速为200-800rpm/min。弃下层，将上层乙酸乙酯萃取液进行减 压旋蒸，然后按照1:1的比例加入正己烷，_20°C过夜，析出的晶体即为粗品。粗品经过3次重 结晶即得到纯品。
[0030] 将上述三种突变菌株T3A、T3S和T3V发酵液经多次重结晶后制备的纯品分别上分 析型液相岛津SCL-2010A进行分析，条件如下： 分析用柱：Agilent Eclipse Plus C18，100mmX4.6mm，3.5ym 流动相：：A:蒸馏水中含0.1 % TFA B:乙腈中含0.1%TFA 梯度：梯度洗脱 0-10min:40%B-55%B;10-15min:55%B ;15-18min:55%B-60%B; 20-23min：40%B； 柱温:40°C; 流速：lml/min; 波长:330nm; 进样量:20μ1。
[0031] 色谱图如图1、图5和图9所示，从上述三种突变菌中共各自分离了 1种化合物，分别 命名为化合物1、2、3，其中化合物1从菌株Τ3Α发酵液中分离得到，化合物2从菌株T3S发酵液 中分离得到，化合物3从菌株T3V发酵液中分离得到。
[0032] (1)化合物1结构解析 如图1所示，目标化合物的出峰时间在7. lmin左右，纯度大于95 %。
[0033]经高分辨质谱检测（图2)，目标化合物的精确分子量为1192.1814,分子式为 C51H43N13011S6。进一步经结合氢谱（图3)、碳谱（图4)及核磁数据（表1)对其进行结构分 析。
[0034]表1化合物1的NMR核磁数据
通过解析，得到了化合物1的化学结构如下： (2)化合物2：结作」胛个/T
如图5所示，目标化合物的出峰时间在5.8min左右，纯度大于95 %。
[0035]经高分辨质谱检测（图6)，目标化合物的精确分子量为1208.1530,分子式为 C51H43N13011S6。进一步经结合氢谱（图7)、碳谱（图8)及核磁数据（表2)对其进行结构分 析。
[0036]表2化合物2的NMR核磁数据
通过解析，得到了化合物2的化学结构如下：
(3)化合物3结构解析 如图9所示，目标化合物的出峰时间在5.3min左右，纯度大于95 %。
[0037]经高分辨质谱检测（图10)，目标化合物的精确分子量为1220.1735，分子式为 C51H43N13011S6。进一步经结合氢谱（图11)、碳谱（图12)及核磁数据(表3)对其进行结构分 析。
[0038]表3化合物3的NMR核磁数据
通过解析，得到了化合物3的化学结构如下： 化合物丨卜rn
为了对测试化合物的抗菌活性进行评价和比较，采用倍比稀释法对不同测试菌株的最 低抑菌浓度(MIC)进行检测。在Mueller-Hinton肉汤培养基中，37°C培养18-24小时后，观察 并记录细菌的生长情况，进而得到最低抑菌浓度(μg/ml)。
[0039] 待测化合物对不同的菌株的MIC值如下表所示(单位:μg/ml)，根据表中的数值可 知，下列3种化合物具有较强的抑菌作用。
[0040] 表4诺西肽衍生物的抗菌活性分析
【主权项】
1. 具有下式结构的诺西肤类衍生物或其药学上可接受的盐、醋、对映异构体、非对映异 构体或混合物：其中，R为C出、C出OH或CH( C出)2。2. 如权利要求1所述的诺西肤类衍生物或其药学上可接受的盐、醋、对映异构体、非对 映异构体或混合物，其特征在于所述化合物具有如下结构式：3. 如权利要求1所述的诺西肤类衍生物或其药学上可接受的盐、醋、对映异构体、非对 映异构体或混合物，其特征在于所述化合物具有如下结构式：4. 如权利要求1所述的诺西肤类衍生物或其药学上可接受的盐、醋、对映异构体、非对 映异构体或混合物，其特征在于所述化合物具有如下结构式：5. 如权利要求1-4之一项所述的诺西肤衍生物或其药学上可接受的盐、醋、对映异构 体、非对映异构体或混合物在制备抑菌或抗菌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开发明了一类新型的诺西肽衍生物，包括诺西肽衍生物1、2和3。这类化合物通过定向改变诺西肽生物生物合成基因簇中nosM基因来达到产生新型的具有抗菌活性的诺西肽衍生物。
【IPC分类】A61P31/04, C07K5/097, A61K38/06
【公开号】CN105646650
【申请号】
【发明人】陈依军, 郑徐露, 王淑珍
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月29日