一种高效定点转基因的工具及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高效定点转基因的工具。
【背景技术】
[0002] 定点转基因是将目的基因精确的整合到基因组的预定位置，可以有效的避免外源 基因的随机整合，造成宿主基因的插入突变从而产生不可预知的影响。此外，外源基因整合 到基因组中非活跃区受到位置效应影响导致外源基因表达量低或者表达完全沉默。通过基 因组学研究以及生物信息分析，发现在动物基因组中存在一些基因表达的安全位点，外源 基因整合到基因组中的该位点时，外源基因既不会影响动物本身基因组的稳定和安全，外 源基因的表达也不会受到染色体状态影响。大量研究发现小鼠的R0SA26以及人AAVS1和 hR0SA26位点可作为转基因的安全位点。随着人类基因组研究进一步深入，越来越多的转基 因安全位点将会被发现，应用于转基因动物制备或是细胞或者基因治疗。
[0003] 怎样将外源的基因高效的整合到这些安全位点，一直是困扰科学家的难题。虽然 利用基因打靶技术以及将外源基因精确的整合到基因组中的靶位点，但是同源重组的效率 只有1〇_ 7,且操作过程繁琐，劳动量巨大。最近发展ZFN、TALEN以及CRIPSR/Cas9基因编辑技 术可以精确的切割动物细胞基因组DNA，可以人为制造细胞基因的插入或是缺失突变;虽然 ZFN、TALEN、CRIPSR/Cas9切割基因组DNA，DNA双链断裂可以有效的提高同源重组效率，如果 在供体模板DNA中插入外源基因也可以显著提高基因定点敲入的效率，但其本质仍然是同 源重组，定点转基因效率仍然偏低。
[0004] CRISPR是在古细菌中发现的一种抵抗噬菌体入侵的免疫系统，近年来科学家根据 CRISPR/Cas9的生物学特性，将其改造成为动物基因组DNA的基因编辑技术。
[0005] 转座子是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位 置的过程被称为转座。DNA转座子增效切离-粘贴机制，及在转座酶的催化下，DNA转座子从 原始位置切离并插入到新的基因组位置。Piggbac(PB)转座子是一种能在哺乳动物细胞中 发挥高效转座功能的DNA转座子，能将转座子基因随机插入到哺乳动物基因组中TTAA位点。 TO转座子系统包含一个约为64kDa的转座酶，其供体质粒左端包含306bpPBL序列和右端包 含237bpPBR序列。利用Piggbac转座子系统能够在动物细胞中实现高效的转基因，但是外源 基因整合方式仍然为随机整合，因此实际应用中存在安全隐患。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高效定点转基因的工 具。
[0007] 研究发现Cas9蛋白第十位氨基酸残基D突变为A，第840位氨基酸残基Η突变为A (D10A和H840A)，双突变的CRISPR/Cas9系统能够根据导向RNA(gRNA)序列结合到基因组的 特异性位点，但其内切酶活性完全消失，因此不能切割基因组DNA。
[0008] 为了实现高效的定点转基因，本发明利用piggbac转基因效率高的优点，并且结合 双突变CRISPR/cas9系统的靶向功能。利用基因工程技术，将二者融合成为一种能够实现高 效定点转基因的DNA转座子系统。
[0009] 具体而言，本发明的技术方案如下：
[0010] 第一方面，本发明提供一种高效定点转基因的工具，所述工具包含或可产生： gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点。
[0011] 该工具可为重组表达载体，也可为其他形式的转基因工具，只要其在定点转基因 方面应用时，利用"gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶"复合物实现高效的定点 转基因，该工具即在本发明的保护范围之内。
[0012] 为了更好地实现转基因目的与效果，本发明所述的不具备内切酶活性的Cas9蛋白 为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基Η突变为A的双突变Cas9蛋白。
[0013] 基于上述技术方案，本发明给出一个具体的转基因工具，即一种高效定点转基因 的载体，所述载体包含：
[0014] 1)可转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列；
[0015] 2)编码双突变Cas9蛋白的核苷酸序列;所述双突变Cas9蛋白为第十位氨基酸残基 D突变为A、第840位氨基酸残基Η突变为A的Cas9蛋白；
[0016] 3)编码PB转座酶的核苷酸序列。
[0017] 所述载体的表达产物中，tracrRNA与crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体gRNA， 双突变Cas9蛋白与PB转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链连接，gRNA引导双突变Cas9蛋 白与PB转座酶靶向作用于基因组特定位点。
[0018]该gRNA需要针对具体的特异靶向位点进行设计，设计过程可根据本领域常规设计 方法进行，设计过程本发明不另作限定。gRNA的具体序列本发明也不另作限定，本领域技术 人员可以理解为任意一个可针对基因组特定位点的 gRNA，只要能实现靶向引导作用即可。 [0019] 双突变Cas9蛋白与1?转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链（linker)连接的目 的在于，在该linker的存在下，双突变Cas9蛋白与1?转座酶避免空间位阻对重组蛋白各功 能域的影响，高效的发挥各功能域的活性。
[0020] 综上，上述载体将表达"gRNA-双突变Cas9蛋白-1 inker-PB转座酶"复合物，双突变 Cas9蛋白与PB转座酶将由gRNA靶向引导至基因组的特异性位点。当存在外源目的基因时， 双突变Cas9蛋白与PB转座酶将发挥作用，实现外源目的基因的定点转座。
[0021 ] 作为优选，所述tracrRNA与crRNA在U6和H1启动子的驱动下转录，提高二者配对形 成gRNA的效率。
[0022] 作为优选，所述载体中含有CMV增强子，目的在于提高融合蛋白的表达效率。
[0023] 为了更好地利用所述载体表达上述复合物，本发明为载体中的主要元件提供一个 具体的连接方式，从5 '到3 '端依次为U6启动子驱动crRNA表达框，CMV启动子驱动Cas9蛋白-PB转座酶融合蛋白表达框，H1启动子驱动tracrRNA框。参见图2。
[0024] 第二方面，本发明提供一种高效定点转基因的方法，如图1所示，将前述工具或前 述载体，与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中。即可将外源目的基因的转座到 基因组中的目标特异性位点上，从而实现定点转基因。本发明构建的载体所表达目的产物 可以将任意外源基因定点整合到目的位置。
[0025]第三方面，本发明提供一种具体针对人R0SA26位点高效转基因的方法，将前述载 体与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中；其中，转录tracrRNA和crRNA的核苷酸 序列分别为 aaacGAGGCTGTGCTTCGGCGCTC 和 taaaGAGCGCCGAAGCACAGCCTC〇
[0026] 进一步说明，tracrRNA序列是固定的，crRNA是要根据革El点来设计的，设计的寡聚 核酸退火后形成种子DNA，用酶Bbsl切开crRNA表达匡后，插入靶点互补配对的序列大约 20bp，表达的crRNA产物即可与革E1向的DNA发生互补配对。
[0027] 同理，当目的基因需要定点转入其他位点时，本领域技术人员可针对目标位点设 计相应的用于转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列，使二者配对后的RNA二聚体具有靶向该 目标位点的功能。
[0028] 第四方面，本发明还提供了前述工具或前述载体在高效定点转基因方面的应用。 [0029]本发明的有益效果在于：
[0030]本发明利用蛋白肽链将PB转座酶与双突变的Cas9蛋白连接成为一种新型重组蛋 白。通过设计靶向动物基因组的导向RNA(gRNA)，在U6和H1启动子驱动下转录crRNA和 tracrRNA二聚化形成gRNA;在gRNA与定点转座酶共表达情况下，1?转座酶随着CRISPR/cas9 和gRNA的复合物靶向到基因组的特异位置，PB转座酶在特异的位点实现转座功能，如此同 时共转染供体质粒(包含有外源目标基因的载体），即可将外源的目标载体转座到基因组中 特异性位点，从而实现定点转基因。该体系创新性的结合突变CRISPR/cas9靶向性与 piggbac高效转座功能，载体表达的重组蛋白具有定点转座功能，从而实现高效的定点转基 因。
【附图说明】
[0031 ]图1为本发明所述定点转基因方法的示意图。
[0032]图2为本发明所述高效定点转基因载体的示意图。
[0033]图3为本发明实施例1所述载体的构建流程图。
【具体实施方式】
[0034] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0035] 下述实施例中所使用的实验