一种iNKT淋巴细胞的扩增激活方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学领域，具体是指使用转染了多种蛋白质的宿主细胞，联合多种蛋白共同作用定向扩增激活iNKT细胞的方法。
【背景技术】
[0002]iNKT细胞治疗对多种肿瘤例如:肺癌、头部和颈部鳞状细胞癌、肉瘤癌和急性白血病等肿瘤治疗有明显疗效。目前iNKT细胞治疗在美国主要用来和手术、化疗和放疗联合使用解决肿瘤的复发问题。iNKT细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量高纯度的iNKT细胞非常困难。传统使用的白介素2联合α-半乳糖神经酰胺扩增生长的倍数有限(平均100倍)；纯度低(20 %-30 % );扩增后的iNKT细胞杀伤功能低下，不能满足临床需求。本发明人之前的发明采用转染⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、CD86、⑶163和CD137L蛋白质的K562细胞(以下简称宿主细胞)用于扩增NK细胞。本发明将宿主细胞结合传统使用的α-半乳糖神经酰胺和白介素2定向扩增激活iNKT细胞，解决了 iNKT数量和纯度的问题，能够充分满足临床治疗的需求。
【发明内容】
[0003]本发明针对现有技术中的不足，提出一种更加有效的iNKT淋巴细胞的扩增激活方法。
[0004]本发明是通过下述技术方案得以实现的:一种iNKT淋巴细胞的扩增激活方法，使用转染了蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F的宿主细胞，联合蛋白质Α1、α_半乳糖神经酰胺共同对淋巴细胞进行扩增激活，得到iNKT淋巴细胞;所述蛋白质A包含CD8a的完整片段和白介素21的功能片段；蛋白质B包含CD14的功能片段；蛋白质C包含CD19的功能片段;蛋白质D包含CD86的功能片段;蛋白质E包含CD163的功能片段;蛋白质F包含CD137L的功能片段;蛋白质Al包含白介素2的功能片段。
[0005]进一步地，所述宿主细胞为K562细胞。
[0006]进一步地，所述的蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F的剂量均为50pM-1000pM。蛋白质Al和a-半乳糖神经酰胺的剂量在1-100纳克/毫升。所述宿主细胞与淋巴细胞的用量比例(数量比)为宿主细胞:淋巴细胞=1-10:1，更优选地，为宿主细胞:淋巴细胞= 1-4:1，最优选地为1:1。
[0007]进一步地，所述蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F为纯化的蛋白质或由宿主细胞在细胞膜表面即时表达，蛋白质Al为纯化的蛋白质；所述纯化是指质量分数在90%以上。
[0008]进一步地，所述蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F分别为CD8a_白介素21复合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8a为在宿主细胞膜上表达的膜蛋白，⑶8a连接白介素21后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；CD14、⑶19、CD86和CD137L均为膜蛋白。[0009 ] 进一步地，所述淋巴细胞选自外周血淋巴细胞、脐带血淋巴细胞、i NKT细胞中的一种或多种，或者为外周血淋巴细胞、脐带血淋巴细胞、iNKT细胞中的一种或多种和其它淋巴细胞的组合，或为白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、CD163、⑶137L、白介素2中的一种或多种按照任意比组成的混合物作用于人体血管中的血液所产生的淋巴细胞。
[0010]进一步地，转染了蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F的宿主细胞通过蛋白稳定表达系统得到。
[0011]进一步地，所述方法包括:
[0012](I)对转染了蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质E、蛋白质F的宿主细胞进行致死处理;所述致死处理选自强酸、强碱、辐照(剂量为100Gy-1000Gy)。
[0013](2)在含有淋巴细胞的培养液中，加入步骤I处理后的宿主细胞、以及蛋白质Α1、α-半乳糖神经酰胺共同培养7天;使得所述的蛋白质Α、蛋白质B、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质Ε、蛋白质F的量均为50ρΜ-1000ρΜ。蛋白质Al和α-半乳糖神经酰胺的剂量在1-100纳克/毫升。所述宿主细胞与淋巴细胞的用量比例(数量比)为宿主细胞:淋巴细胞=1-10:1，更优选地，为宿主细胞:淋巴细胞= 1-4:1，最优选地为1:1。
[0014](3)经培养后，辐照后的宿主细胞破裂，将培养后的培养液离心，获取存活的淋巴细胞沉淀，并用培养液重悬；
[0015](4)加入辐照处理后的宿主细胞，使得宿主细胞与淋巴细胞的用量比例(数量比)为宿主细胞:淋巴细胞=1-10: I，更优选地，为宿主细胞:淋巴细胞=1-4: I，最优选地为I: I培养7天;经培养后，辐照后的宿主细胞破裂，将培养后的培养液离心，获取存活的淋巴细胞沉淀，即得到iNKT淋巴细胞；
[0016]其中，所述培养液由100体积的1640培养液和10体积的胎牛血清组成。
[0017]一种iNKT淋巴细胞的应用，其特征在于，所述应用为，将iNKT淋巴细胞用于制备治疗癌症、传染性疾病、糖尿病、或器官移植的药物。
[0018]本发明的有益效果在于:
[0019](I)本发明在转染⑶8α-白介素21功能片段和⑶137L功能片段的K562细胞的基础上，转染了⑶14功能片段、CD19功能片段、CD86功能片段、CD163功能片段。Κ562细胞上转染的CD14功能片段、CD86功能片段、CD163功能片段有助于激活iNKT细胞识别并杀伤微环境中M2类型的肿瘤相关巨噬细胞;转染CD19功能片段有助于激活iNKT细胞识别并杀伤B细胞。
[0020](2)本发明提供体外扩增和激活iNKT的方法比传统的用α-半乳糖神经酰胺和白介素2扩增和激活iNKT细胞的方法，扩增的数量提高22倍;扩增后PBMC中的iNKT细胞的纯度从I %提高到98.5%。动物实验结果表明:与用传统的方案扩增的iNKT细胞相比，采用本发明扩增的iNKT细胞显著提高了对小鼠体内肿瘤的杀伤能力。
[0021](3)本发明通过宿主细胞;α-半乳糖神经酰胺和白介素2功能片段培养扩增激活的iNKT提高病人的免疫力来帮助病人抵抗肿瘤，抵抗病毒和细菌。
【附图说明】
[0022]图1.1NKT细胞体外扩增线性图，显示iNKT淋巴细胞在本发明通过宿主细胞;α-半乳糖神经酰胺和和白介素2共同作用下线性增长。α-半乳糖神经酰胺和和白介素2扩增iNKT细胞作为对照；
[0023]图2.PBMC中iNKT细胞体外扩增线性图，显示iNKT细胞在宿主细胞;α-半乳糖神经酰胺和白介素2共同作用下线性增长。α-半乳糖神经酰胺和和白介素2扩增PBMC中的iNKT细胞作为对照；
[0024]图3.PBMC中iNKT细胞体外扩增流式细胞仪数据图，PBMC细胞在宿主细胞;α-半乳糖神经酰胺和和白介素2共同作用下培养14天和21天后iNKT细胞(⑶3+/Va24_Jal8)的比例显著增长。a-半乳糖神经酰胺和和白介素2扩增iNKT细胞作为对照；
[0025]图4.1NKT细胞杀伤肿瘤细胞图，PBMC细胞在宿主细胞;a-半乳糖神经酰胺和和白介素2共同作用培养14天后，丨爾1'细胞对1(562、？03^549、他?62肿瘤细胞的杀伤作用。€[-半乳糖神经酰胺和和白介素2扩增PBMC中iNKT细胞作为对照；
[0026]图5.1NKT细胞杀伤TAMs细胞，I3BMC细胞在宿主细胞;a-半乳糖神经酰胺和和白介素2共同作用培养14天后，iNKT细