一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用
【技术领域】
[0001] 发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD 及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖 层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β_1，4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交 联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽 聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、个细菌的抗干燥能力和耐热性等 均密切相关。dacD基因表达的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一 个末端D-Ala，导致转肽反应中供体不可用，可以控制肽聚糖的网状交联水平，从而改变细 胞的通透性。
[0003] 大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统是目前基因工程中最常用的蛋白表达系 统，有操作简单、成本低廉等优点，可以快速大规模地生产目的蛋白。但是在E.coli的表达 过程中，大部分蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质 的生产造成阻碍。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可以提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧 肽酶、其氨基酸序列、编码该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因、含有该基因的重组质粒、含 有该重组载体的重组菌株、该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的应用。
[0005] 具体包括：
[0006] 本发明提供了一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其氨基酸序列如序列1所示。
[0007] 序列 1:
[0008] MKRRLIIAASLFVFNLSSGFAAENIPFSPQPPEIHAGSWVLMDYTTGQILTAGNEHQQRNPASLTKLMTGYVVDRAI DSHRITPDDIVTVGRDAWAKDNPVFVGSSLMFLKE⑶RVSVRDLSRGLIVDSGNDACVALADYIAGGQRQFVEMMNN YAEKLHLKDTHFETVHGLDAPGQHSSAYDLAVLSRAIIHGEPEFYHMYSEKSLTWNGITQQNRNGLLWDKTMNVDGL KTGHTSGAGFNLIASAVDGQRRLIAVVMGADSAKGREEEAKKLLRWGQQNFTTVQILHRRKKVGTERIWYGDKENIA LGTEQEFWMVLPKAEIPHIKAKYTLNGKELTAPISAHQRVGEIELYDRDKQVAHWPLVTLESVGEGSMFSRLSDYFH HKA
[0009] 其中，该酶基因编码388个氨基酸，其理论分子量为43.33kDa。
[0010] 本发明提供了编码上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因 dacD，具体的，该酶的基 因序列如序列2所示。
[0011] 序列2:
[0012] TTGAAACGCCGTCTTATTATTGCTGCTTCTTTGTTCGTTTTTAATTTATCGTCTGGTTTTGCGGCGGAAAACATTCC TTTTTCACCTCAGCCTCCAGAGATTCATGCCGGGTCCTGGGTATTGATGGATTACACCACCGGTCAGATTCTCACCG CGGGTAATGAGCATCAACAGCGCAATCCCGCCAGCCTGACAAAGCTGATGACGGGCTATGTCGTGGATCGCGCTATC GATAGTCATCGCATTACGCCAGACGATATTGTCACCGTGGGGCGTGATGCGTGGGCGAAAGATAATCCGGTGTTTGT CGGTTCTTCACTGATGTTTTTGAAAGAGGGCGATCGCGTATCGGTACGTGATTTAAGCCGAGGTTTAATTGTGGATT CCGGAAATGACGCGTGTGTTGCTCTGGCTGACTATATTGCCGGTGGGCAACGGCAGTTTGTTGAAATGATGAACAAC TATGCCGAGAAGCTGCATCTCAAGGATACGCATTTTGAAACAGTGCATGGTCTGGATGCACCTGGCCAGCATAGCTC GGCTTATGATTTAGCCGTGCTTTCTCGCGCTATCATCCACGGCGAGCCCGAGTTTTATCATATGTACAGTGAGAAAA GCCTCACCTGGAACGGTATCACCCAGCAAAACCGTAACGGGTTATTGTGGGATAAGACCATGAATGTTGACGGCCTG AAAACGGGCCATACTTCTGGTGCCGGGTTTAATCTTATTGCTTCGGCTGTAGACGGGCAGCGTCGCCTCATTGCAGT GGTAATGGGTGCTGACAGCGCAAAAGGTCGTGAGGAAGAGGCAAAAAAATTACTGCGTTGGGGGCAACAAAACTTTA CTACGGTGCAAATTTTGCACCGTAGGAAAAAGGTCGGTACGGAACGCATCTGGTATGGTGATAAAGAAAATATCGCC CTGGGAACGGAACAAGAGTTCTGGATGGTGCTACCGAAAGCCGAAATTCCACATATCAAAGCCAAATATACCCTTAA TGGTAAAGAGCTCACCGCGCCAATTAGCGCCCATCAGCGGGTAGGGGAAATTGAACTTTACGACCGTGATAAACAGG TGGCGCACTGGCCGCTGGTTACCCTGGAATCTGTCGGGGAAGGCAGCATGTTTTCTCGCCTGAGTGATTATTTCCAC CATAAGGCCTGA
[0013] 本发明通过PCR方法克隆了 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD，DNA全序列分析 结果表明，D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因 dacD全长1167bp。
[0014] 将上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD序列及推导出的氨基酸序列在 GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于E · coli str · K_12substr .MG1655的D-丙氨酰-D_丙氨酸羧肽酶序列相似性最高(98% )。
[0015] 本发明还提供了包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD的重组质粒，为 pRSFDuet-dacD。将本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入至表达载体相应的限制酶 切位点，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，作为本发明的一个最优选实验方案，优选 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到质粒pRSFDuet，使该核苷酸序列位于T71ac启动子的 下游并受其调控，得到重组E. coli表达质粒pRSFDuet-dacD。
[0016] 本发明还提供了上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD的应用菌株，优选所述 菌株为E.coli。
[0017] 本发明能够增强E.c〇li胞内蛋白到达胞外，促进其分泌，降低其在胞内积累，提供 一种可提高E.coli蛋白胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、及其氨基酸序列、基因 序列。
【附图说明】
[0018] 图1为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶重组质粒pRSFDuet-dacD图谱。
[0019] 图2为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的过量表达
[0020] 图3为过量表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶对E. coli胞外分泌淀粉酶的影响。
【具体实施方式】
[0021] 实施例l:E.coli BL21(DE3)D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD的克隆
[0022] 基于PCR获得D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD的DNA序列，将D-丙氨酰-D-丙氨酸羧 肽酶的基因片段与表达载体pRSFDuet连接，获得重组质粒pRSFDuet-dacD(图1)。然后转化 到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌株E.coli BL21(DE3)/dacD。
[0023] 实施例2:D_丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶酶活
[0024]将已构建的重组菌，接种250mL摇瓶培养，经诱导剂（IPTG)诱导后，收集E. coli细 胞，采用超声破碎法破壁细胞。高速离心后，收集破壁上清，取样测定破壁上清中的羧肽酶 酶活力。通过测定酶活力计算出过量表达后，羧肽酶dacD-Δρ在胞内的比酶活力为8.10U/g (图2)，对照组羧肽酶比酶活力仅为1.51U/g。
[0025] 实施例3:过量表达dacD对E.coli胞外分泌淀粉酶的影响
[0026] 将构建成功的重组质粒pRSFDuet-dacD，转化到含有淀粉酶重组质粒pETDuet-AmyK的E.coli BL21 (DE3)中后，诱导发酵24h时，过量表达羧肽酶dacD的E.coli胞外分泌重 组淀粉酶的水平显著提高，胞外淀粉酶酶活力达到5.87U/mL(图3)。但没有过量表达任何羧 肽酶的对照菌株诱导发酵24h后，在E.coli胞外测得的重组淀粉酶的酶活力仅为1.74U/mL。
【主权项】
1. 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列组成的 蛋白质。2. -种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD，其特征在于，编码权利要求1所述的D-丙 氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD。3. 根据权利要求2所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD，其特征在于:其DNA序列如 序列2所示。4. 包含权利要求2或3所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacD的重组质粒。5. 根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pRSFDuet。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用。本发明提供了一种来源于大肠杆菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明提供了编码上述dacD的编码基因dacD。本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-丙氨酸(D-Ala)，导致转肽反应中供体不可用，从而控制肽聚糖的网状交联水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。
【IPC分类】C12N9/48, C12N15/57, C12N15/70
【公开号】CN105647893
【申请号】
【发明人】许菲, 杨海泉, 胡金远, 强书敏, 沈微, 陈献忠, 郑虹宁, 宁璐璐
【申请人】江南大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月4日