一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物多样性检测领域，具体涉及一种适用于高通量测序平台的微生 物多样性检测样品制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前，微生物多样性研究的方法主要是变性梯度凝胶电泳，即DGGE技术。该方法与 基于高通量测序方法的微生物多样性研究相比，周期长、成本高、主观性强，因此越来越多 的研究者倾向使用高通量测序平台进行微生物多样性研究。
[0003] 基于高通量测序平台的微生物多样性研究方法分为以下几个步骤:DNA提取、PCR 扩增、文库构建、上机测序和数据分析。其中DNA提取和PCR扩增为样品的准备阶段。DNA的提 取效率和PCR扩增循环数的选择直接影响最终的数据分析，即微生物的原始群落组成分析。 目前尚没有基于高通量测序平台的样品准备标准方法。尤其在不同样品的DNA提取方 法和后续PCR扩增循环数的选择上，各种参数均有涉及，对于分析结果的评价也尚无标准。 而微生物的样品准备，如DNA提取和可变区的扩增等，对于测序完成后的数据分析以及微生 物原始群落组成的影响是至关重要的。本发明针对样品准备过程中的缺陷，对DNA的提取方 法和PCR扩增循环数的选择进行了探索和优化。
【发明内容】
[0004] 本发明确定了一套可用于指导高通量测序前期样品准备，包括DNA提取及扩增条 件的技术参数。
[0005] 本发明提供了一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包 括以下步骤： (1) 将含微生物的样品加入CTAB缓冲液并振荡； (2) 加入至少两种不同粒径的研磨珠并振荡； (3) 37-90°C孵育5-60min后离心取上清； (4) 在步骤(3)得到的上清加入RNAase并孵育； (5) 加入苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清； (6) 在步骤(5)得到的上清中加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (7) 以步骤(6)得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到用于检测的样品。
[0006] 在一个实施方案中，所述不同粒径的研磨珠为至少两种不同粒径的研磨珠，其粒 径各自独立地在〇.〇5 mm至1 mm的范围内且相邻大小的粒径相差0.1至0.6 mm。
[0007] 在一个实施方案中，在步骤（3)中，60-80 °C孵育10-30min后离心取上清；更优选 地，70°C孵育20min后离心取上清。
[0008] 在一个实施方案中，步骤(5)中所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积为步骤(4) 中的上清体积的1-1.5倍;优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积与步骤(4)中的 上清体积相等;优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物中苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为 10-50:10-50:0.5-2;更优选地，苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为20-30: 20-30:1;最优选地， 苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为25:24:1。
[0009]在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增进行25个循环。
[0010]在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增进行30个循环。
[0011] 在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16s V3 区;优选地，其中所述PCR扩增的扩增引物为： F:5，-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3,。
[0012] 在一个优选实施方案中，本发明提供一种适用于高通量测序平台的微生物多样性 检测样品制备方法，包括： (1) 将含微生物的固体样品加入CTAB缓冲液中并振荡； (2) 加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡； (3) 70°C孵育20min后离心取上清； (4) 将上清加入RNAase并孵育； (5) 加入等体积的25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清； (6) 重复步骤(4)和(5); (7) 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (8) 离心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涤后溶解在去离子水中； (9) 以步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。
[0013] 在另一个优选实施方案中，本发明提供一种适用于高通量测序平台的微生物多样 性检测样品制备方法，包括： (1) 将含微生物的液体样品离心除去上清，加入PBS充分重悬后，再次离心除去上清后 向沉淀中加入CTAB缓冲液中并振荡； (2) 加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡； (3) 70°C孵育20min后离心取上清； (4) 将上清加入RNAase并孵育； (5) 加入等体积的25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清； (6) 重复步骤(4)和(5); (7) 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (8) 离心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涤后溶解在去离子水中； (9) 以步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。
[0014] 特别优选地，上述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16s V3区； PCR扩增的扩增引物为： F:5，-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5,-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，；
有益效果 本发明与变性梯度凝胶电泳，即DGGE技术相比，降低了单条序列的测序费用、缩短了测 序时间、简化了实验操作、增加了痕量菌的检测效率。
[0015] 本发明与其他目前使用的基于高通量测序方法的微生物多样性研究相比，考虑了 样品准备过程对最终数据分析，即微生物群落组成分析的影响，形成了一套既能如实反应 样品的群落组成，又能最大程度的获得尽可能多的微生物种类的样品准备方法，对其中的 DNA提取和扩增循环数的选择做了标准化规定。
【附图说明】
[0016] 图1示出了不同方法提取的土壤和食糜样品DNA胶图；S-TG:天根提取的土壤样品 DNA; S-N:新方法提取的土壤样品DNA; C-TG:天根提取的食糜样品DNA; C-N:新方法提取的食 糜样品DNA。
[0017] 图2示出了不同提取方法和扩增循环数对测序数据0TU和稀释曲线的影响:A.不 同提取方法和扩增循环数对土壤样品0TU产出的影响;B.不同提取方法和扩增循环数对土 壤样品稀释曲线的影响;C.不同提取方法和扩增循环数对食糜样品0TU产出的影响;D.不 同提取方法和扩增循环数对食糜样品稀释曲线的影响。
[0018] 图3示出了不同提取方法对微生物数量的影响:A.不同提取方法对土壤样品微生 物数量的影响;B.不同提取方法对食糜样品微生物数量的影响。
[0019] 图4示出了不同扩增循环数对微生物数量的影响。
[0020] 图5示出了不同提取方法对微生物门水平种类的影响:A.扩增循环数为20时，不 同提取方法对土壤样品微生物种类的影响;B.扩增循环数为25时，不同提取方法对土壤样 品微生物种类的影响；C.扩增循环数为30时，不同提取方法对土壤样品微生物种类的影 响;D.扩增循环数为20时，不同提取方法对食糜样品微生物种类的影响;E.扩增循环数为 25时，不同提取方法对食糜样品微生物种类的影响;F.扩增循环数为30时，不同提取方法 对食糜样品微生物种类的影响。
[0021] 图6示出了不同扩增循环数对微生物门水平种类的影响:A.不同扩增循环数对土 壤样品微生物种类的影响;B.不同扩增循环数对食糜样品微生物种类的影响。
【具体实施方式】
[0022] 本发明主要涉及一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法。 该方法对DNA的提取方法和PCR扩增循环数进行优化，并提供一套相辅相成的技术方案，以 下分别对这两个方面进行详细阐述： (1) DNA提取： 与市场上普遍使用的商品化微生物DNA提取试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂 盒)进行比较，本发明采取一种新的提取方法，结果发现，采用本发明提取到的DNA质量更 高，0D260/280的值均在1.7-2.0之间，而天根提取的样品0D260/280的值均大于2.0。琼脂糖 凝胶电泳的结果同样表明，天根提取的样品质量较差，有较多RNA等杂质存在。
[0023]具体方案是： a. 如果是固体样品，则直接称取250mg进行后续操作；如果是液体样品，则首先吸取 1.5ml置于离心管中，12000g离心5min，除去上清，然后加入1.5ml PBS，充分重悬后，12000g 离心5min，再次除去上清后保留沉淀进行后续操作； b. 加入800μ1 CTAB缓冲液，在涡旋振荡器上击打2min(CTAB的配方：CTAB 4g，NaCl 16.364g，lM Tris-HCl 20ml (ρΗ8·0), 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH20溶解，再定容至 200ml灭菌）； c. 加入0.3g 0.1mm研磨珠和O.lg 0.5mm研磨珠，在祸旋振荡器上击打30min; d. 70°C解育20min后，10000g离心10min; e. 将上清转移到新的离心管中，加入5μ1 RNAase (10mg/ml)，37°C孵育30min; f. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)，涡旋震荡30s至液体呈白色乳浊液； g. 12000g 4°C离心10min，取上清液至新的离心管中； h. 重复步骤e、f和g-次； i .加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置5min，然后于-80°C放置30min或过夜 沉淀DNA(视DNA沉淀情况而定，若DNA量很少，则需过夜处理）； j · 12000g离心15min，可以看到白色DNA沉淀； k. 小心倒出上清，加入750μ1 70%的乙醇，充分重悬白色沉淀； l. 12000g离心15min，倒出上清，倒置离心管室温放置10min; m. 加入50-100μ1 70°C预热的去离子水，充分溶解。
[0024] (2)PCR 扩增： a. 选取PCR扩增的起始量为25ng; b. 扩增片段选择16s V3区，扩增引物： 338F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' 518R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'
本发明的关键点有两个:一个是DNA的提取方法。针对环境样品中成分复杂、杂质较多、 菌体细胞壁坚硬程度不同等特点，本发明对CTAB法提取环境微生物DNA的过程进行了改良， 在此过程中加入不同粒径的研磨珠，以增加机械破碎力；增加苯酚/氯仿/异戊醇的萃取步 骤，以最大程度去除杂质；同时对孵育温度和时间进行了调整，力求最大程度的提高提取效 率。另一个是扩增循环数的选择。由于环境样品中微生物的种类繁杂并且含量较低，因此对 于特定的微生物种类需要进行PCR扩增，然后再进行文库构建、上机测序和数据分析等一系 列操作。PCR扩增循环数的选择是非常关键的，如果扩增循环数太多，大多数微生物种类均 达到平台期，则会破坏环境样品中原有的微生物群落结构;如果扩增循环数太少，则会有很 多微生物种类不能被有效检测到。本发明针对复杂和相对简单的环境样品，测试了不同扩 增循环数对最终微生物群落组成的影响。结果发现，对于复杂样品，扩增循环数为25时，不 但微生物的数量和种类最多，并且微生物的群落组成也更接近原始状态;对于简单样品，如 果要关注优势菌的种类和比例，扩增循环数为25，能够兼顾微生物种类和群落组成结构;如 果要关注其中的劣势菌，则选择扩增循环数为30会更有利。
[0025]目前，天根生化科技（北京）有限公司生产的土壤基因组DNA提取试剂盒是使用较 为普遍的强力提取试剂盒，其提取效果与本发明相比，浓度虽然较高，但D