生物催化生产磷酸肌酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷酸肌酸的制备方法的技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术 生产磷酸肌酸的生物催化方法。
【背景技术】
[0002] 磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可兴奋组织(如脑和神经）中的一种 高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以 下七点：（1)心肌保护剂:磷酸肌酸广泛地分布于身体各组织，90%在肌肉组织中，磷酸肌酸 是用来维持ATP水平的，磷酸肌酸通过开放合成通路和减少分解作用，保护肌纤维膜免受缺 血损害并维持细胞的核酸储备。临床用于心麻痹症的心脏保护及心肌代谢窘迫的其他状 况。适用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治疗(辅助治疗），亦可用作各种心脏手术；（2)缓 冲肌肉中酸性物质突然增高；（3)磷酸肌酸(CP)还参与能量运输，即把能量从线粒体运载到 肌肉的其它部位；（4)运动员首选的运补剂:磷酸肌酸对于增加运动员的体能，提高运动成 绩有明显的效果、安全有效，无副作用。在比赛中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高训练和 比赛成绩；（5)ATP的贮存形式:磷酸肌酸可以把高能磷酸转移给ADP生成ATP，因此磷酸肌酸 是ATP的贮存形式；（6)与ADP作用而产生ATP:当体内肌酸磷酸激酶降低至零之前，脑组织缺 氧时，磷酸肌酸均能与ADP作用而产生ATP; (7)缓冲剂的作用:磷酸肌酸除提供能量外，在大 强度练习中还可以对控制肌肉中的酸性物质起缓冲剂的作用，这是因为磷酸肌酸在合成 ATP过程中需要消耗大强度练习中堆积在肌肉中乳酸释放出来的氢离子，而肌肉中氢离子 过多会阻碍肌肉收缩，所以磷酸肌酸能起缓冲作用并推迟疲劳的出现。
[0003] 现有技术中，磷酸肌酸的生产方法包括化学合成法和生物催化法。化学合成法具 有反应条件苛刻、激烈、不易控制，生成产物复杂，污染环境，合成过程中需要用到有毒且易 燃的原料等缺点；而生物催化法则是以肌酸和ATP为底物，在肌酸激酶的催化下，专一生成 磷酸肌酸，具有反应条件温和、反应速度快、专一性强及低碳环保等优点。但是，由于肌酸激 酶的活力较低，且来源受限，致使磷酸肌酸的生产成本过高，严重制约了磷酸肌酸生物催化 法的规模化和产业化生产。
【发明内容】
[0004] 针对上述【背景技术】中提到的磷酸肌酸现有生产方法存在的缺陷，本发明的目的在 于提供一种产率高、成本低、适于大规模工业化生产的磷酸肌酸的生物催化生产方法。
[0005] 为实现上述目的，发明人对具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的Oryctolagus cuniculus肌酸激酶亲本基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在LB培养基 上筛选，从而获得了具有高催化活性的肌酸激酶突变体，因此，本发明提供了一种生物催化 生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化 作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0006] 上述肌酸激酶突变体可以是未经纯化的粗酶形式;也可以是经部分纯化或完全纯 化的酶，纯化过程可采用常规的Histag法;如果需要，还可以是利用固化技术制成的固相酶 或者固相细胞形式的固化酶。
[0007]优选地，所述肌酸与所述三磷酸腺苷的摩尔比为20:1。
[0008] 优选地，所述催化过程还需加入MgCl2和三聚磷酸钠。
[0009] 优选地，所述催化过程是在pH值为7~8的缓冲溶液中进行。
[0010] 所述缓冲溶液优选为Tr is-HCl缓冲溶液。
[0011] 优选地，所述肌酸激酶突变体为固定在酶固定化载体上的固定化肌酸激酶突变 体。
[0012] 所述酶固定化载体优选为环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型 聚N-氨乙基丙稀酰胺-聚乙稀。
[0013] 优选地，所述固定化肌酸激酶突变体的加入量为0.01-0.5g/ml缓冲溶液。
[0014] 优选地，所述固定化肌酸激酶突变体的制备方法包括以下步骤：
[0015] ⑴制备洗酶缓冲液：〇.〇2M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值为7.0;
[0016] (2)制备PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氢钾，pH值为7 · 5;
[0017] (3)用步骤（1)制备的洗酶缓冲液将所述肌酸激酶突变体稀释至5-10mg/ml，并将 得到的酶稀释液与步骤(2)制备的PB溶液等体积混合，再加入所述酶固定化载体，于摇床中 反应，所述酶固定化载体的加入量为10毫克酶/克载体；
[0018] (4)待步骤(3)反应完全后将所得反应液过滤，并用步骤（1)制备的洗酶缓冲液清 洗，即得固定化肌酸激酶突变体。
[0019]以Oryctolagus cuniculus肌酸激酶亲本的基因为模板制备上述肌酸激酶突变体 的方法优选包括以下步骤：
[0020] (l)PCR扩增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶亲本，扩增引物对 如下
[0021] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0022] ckm-R:5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0023] (2)步骤(1)扩增的产物经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒A;
[0024] (3)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得F-YR片段，扩增引物对如下
[0025] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0026] 100YR:5'TTCCTATTATACATCTCTGGCCTTTTTACCTCATA3'；
[0027] (4)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得YF-R片段，扩增引物对如下
[0028] 100YF:5'AGAGATGTATAATAGGAAAGAATATTCAGGAAC 3'，
[0029] ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '；
[0030] (5)以步骤(3)得到的F-YR片段以及步骤(4)得到的YF-R片段为模板，PCR扩增得全 长突变体基因 F100Y，扩增引物对如下
[0031] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0032] ckm-R：5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0033] (6)步骤(5)得到的FI 00Y经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒B;
[0034] (7)将步骤(6)得到的质粒B转化感受态细菌细胞中，对转化细菌进行增殖培养并 诱导表达，然后进行细胞破碎处理，提取即得肌酸激酶突变体。
[0035] 本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，载体优选为pRSET-A。当然，其 还可采用任何适用的其他载体，例如:包括PRSET和pES21在内的原核表达载体、包括pUCl 8/ 19和pBluscript-SK在内的克隆载体等。
[0036] 本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，所获得的肌酸激酶突变体基因 可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原 核细胞或真核细胞胞外表达。
[0037] 本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，载体的宿主细胞可以是包括大 肠杆菌在内的原核细胞，也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
[0038] 有益效果：
[0039] 本发明提供的磷酸肌酸的生物催化生产方法除具备传统的生物催化方法所共同 具备的反应条件温和、反应速度快、专一性强及低碳环保等优点之外，还兼具目前现有的磷 酸肌酸的生物催化方法所不具备的产率高、成本低、适于大规模工业化生产的优点。前述后 一部分优点的获得在本发明中主要来源于以下两个方面：1、经酶活性测定，本发明人工诱 导获得的具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的肌酸激酶突变体的比活性较肌酸激酶亲 本高出111% ;2、经过固定化的肌酸激酶突变体具有更高的活力和更好的稳定性，可提高酶 重复使用率。经试验证实，本发明提供的生物催化方法使肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超 过 85 %。
【附图说明】
[0040] 图1为肌酸激酶亲本与肌酸激酶突变体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0041] 图中，从左至右的三条泳道依次为蛋白分子量标准、肌酸激酶亲本粗提蛋白（A)、 肌酸激酶突变体粗提蛋白（B)，箭头所指示为目的酶的位置。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发 明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造 商建议的条件进行。
[0043] 实施例1
[0044]肌酸激酶亲本基因的扩增与克隆
[0045] 肌酸激酶亲本系指来自Oryctolagus cuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列 如SEQIDN0:l所示（参考GenBankNM_001082239)，氨基酸序列如SEQIDN0:2所示（参考 GenBank ΝΡ_00 1075708 )。根据肌酸激酶亲本的基因序列设计引物对ckm-F: 5' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3 ' 和ckm-R: 5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '。用引 物对ckm_F和ckm-R从Oryctolagus cuniculus cDNA文库中扩增肌酸激酶编码基因。
[0046] 扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4， 0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F， 400nM引物ckm-R，100ng cDNA，1.0U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA)，再用无菌水调反应体 积至50ml。
[0047] PCR扩增反应程序为:95°C3分钟，35圈循环:95°C50秒、50°C30秒和72°C1分钟，最 后7 2 °C 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶Nd e I和BamH I酶切后与经同样限制性内切酶 Ndel和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自 Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-ckm。经DNA测 序，确定该被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列，具体示于序列表中