一种禽源沙门氏菌多重pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂 盒及其非诊断性检测方法，特别涉及血清型为肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙 门氏菌。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，主要寄居于人和动物的肠道中，研究表 明由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。世界 卫生组织(WHO)的调查表明全球每年有1.3 X 108例人类胃肠炎是由沙门氏菌感染引起的， 其中死亡病例高达300万。
[0003] 家禽被认为是沙门氏菌的主要储库，而人类感染通常归因于受污染的家禽制品 (包括禽肉与禽蛋）。目前已报道的沙门氏菌血清型总数超过2600种，其中与家禽相关的血 清型只占10%，而引起家禽严重感染及食品安全的血清型主要包括肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙 门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌三种。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌主要通过粪口途径感染家 禽，经过消化道定植后再侵入包括生殖道在内的多种脏器。因此，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙 门氏菌可以感染鸡蛋进而传播给人类，造成严重的公共卫生问题。与此相反的是，鸡伤寒沙 门氏菌属于宿主特异性血清型，可引起各种年龄段鸡发生严重的系统性疾病，给家禽业造 成严重的经济损失。由于上述三种血清型沙门氏菌在公共卫生和家禽生产领域的重大影 响，肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌已成为全球家禽领域最急需净化的 血清型。鉴于上述血清型沙门氏菌对家禽生产与公共卫生的重要性，迫切需要建立一种快 速、实用的方法进行特异性检测。
[0004] 由于传统沙门氏菌检测技术上存在诸多缺陷，如:操作步骤烦琐耗时（需依次经过 预增菌，选择性增菌，生化与血清学鉴定），不能满足及时有效的质量监测和疾病防控需求； 灵敏度较低，当样品中沙门氏菌含量较低时，易造成假阴性结果;准确度不高，尤其是加工 后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门氏菌形成营养缺陷型，用传 统方法不易检出。
[0005] 为了能够快速、准确、简便的检验上述三种禽源沙门氏菌，以分子生物学为基础的 检测鉴定方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法 之一。其中，多重PCR技术在保留了PCR方法敏感、特异、简便、快速等优点的同时，以其高效 性成为了多病原同时检测的重要技术之一。但由于多重PCR实验设计较单一 PCR更为复杂， 在建立多重PCR反应体系时需考虑引物间的相互干扰，还需对其中的主要成分和反应条件 进行繁琐的优化，因而限制了该方法的广泛运用。
[0006] 本发明根据已知的沙门氏菌全基因组序列，通过分析筛选出肠炎沙门氏菌、鸡伤 寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌三种血清型的特有基因序列，设计多重PCR引物，建立检测方 法。该方法可用于禽源样品中肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性 检测。
【发明内容】
[0007] 本发明针对传统技术在检测禽源沙门氏菌中存在的不足，提供了一种特异性检测 三种重要禽源沙门氏菌血清型(肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）的多重 PCR试剂盒及其非诊断性检测方法。
[0008] 本发明技术方案如下： 本发明提供了一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述禽 源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒包括10XPCR缓冲液、2.5 U/μΙ Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物包括肠炎沙门氏菌 ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA;所述阴性对 照为灭菌双蒸水。
[0009] 进一步的，所述多重PCR检测体系的组分为:每25μ1反应液中包括10XPCR缓冲液 2.5yl、dNTPs 2yl、Taq DNA聚合酶0.25μ1、检测引物组3yl、DNA模板1~2μ1以及适量的灭菌 双蒸水。
[0010] 进一步的，所述多重PCR检测方法程序为:94°C预变性5min;94°C变性 30s;56°C退火30s;72°C延伸30s;共30个循环，最后72°C延伸8min。
[0011]进一步的，所述 10XPCR缓冲液含有 100mM KCl、80mM (NH4)S〇4、pH为9.0的 100mM Tris-HCl、15mM MgCh和0.5% Tergitol-type NP-40〇
[0012]进一步的，所述阳性对照中肠炎沙门氏菌的扩增引物序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，鸡伤寒沙门氏菌的扩增引物序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，鼠伤寒沙门 氏菌的扩增引物序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
[0013] 进一步的，所述肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的引物对浓度均 为10 μΜ，等体积混合后得到检测引物组。
[0014] 进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
[0015] 更进一步的，一种使用禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒进行非诊断性检测的方 法，包括以下步骤： S1:使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
[0016] 32:多重?0財广增，将10\?0?缓冲液、(1犯1^、了&9〇嫩聚合酶、检测引物组以及0嫩 模板加入无菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μ1，同时设置阳性、阴性对照，使用 PCR仪进行扩增反应;采用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
[0017]相比于现有技术，本发明的有益效果为： 本发明根据三种禽源沙门氏菌(肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)含 有的特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点，同时，本发明通过一次反应， 即可对三种家禽主要优势血清型沙门氏菌进行快速检测与分型，相比传统的血清学分型与 普通PCR检测，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
【附图说明】
[0018]图1为实施例1中多重PCR检测方法的凝胶电泳展示图。图中:Μ为DL-500 marker， 泳道1-3分别为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌，泳道4为阴性对照； 图2为实施例2中多重PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图。图中:M为DL-500 marker;泳道1-39为沙门氏菌标准株检测结果，分别为纽波特沙门氏菌ATCC6962、蒙特维的 亚沙门氏菌ATCC8387、圣保罗沙门氏菌CICC21486、波茨坦沙门氏菌CICC21500、布洛克利沙 门氏菌CICC21489、鸡伤寒沙门氏菌ATCC10398、海德尔堡沙门氏菌CMCC50111、肯塔基沙门 氏菌CICC21488、婴儿沙门氏菌CMCC50348、汤卜逊沙门氏菌CMCC50023、阿贡纳沙门氏菌 CICC21586、鸡伤寒沙门氏菌ATCC19945、山夫登堡沙门氏菌CMCC50050、亚利桑那沙门氏菌 CMCC50166、火鸡沙门氏菌CMCC50329、科特布斯沙门氏菌CMCC50123、都柏林沙门氏菌 CMCC50042、雷丁沙门氏菌CMCC50103、鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184、德比沙门氏菌CMCC50112、 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50001、埃森沙门氏菌CMCC50720、吉 夫沙门氏菌CMCC50773、鸭沙门氏菌CMCC50774、弗雷斯诺沙门氏菌CMCC50908、斯特拉斯堡 沙门氏菌CMCC50872、肠炎沙门氏菌ATCC13076、猪霍乱沙门氏菌CICC21493、鼠伤寒沙门氏 菌CMCC50015、明尼苏达沙门氏菌CMCC50061、巴森海德沙门氏菌CICC21587、巴雷利沙门氏 菌CMCC50740、圣地亚哥沙门氏菌CMCC50716、加明那拉沙门氏菌CMCC50141、鸡伤寒沙门氏 菌CMCC50770、翁德斯太浦沙门氏菌CMCC50138、奥拉宁堡沙门氏菌CMCC50121和肠炎沙门氏 菌CMCC50041;泳道40-47为非沙门氏菌标准株检测结果（分别为禽多杀性巴氏杆菌 CVCC44801、奇异变形杆菌ATCC12453、大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、宋内氏志贺氏菌ATCC9290、空肠弯曲杆菌ATCC12022 和肺炎克雷伯氏菌ATCC700603;泳道48为灭菌双蒸水。
[0019]图3为实施例3中多重PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图中:M为DL-500 marker， 泳道 1-5 为鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 梯度稀释样品 ，泳道 6-10 为鸡伤寒沙门 氏菌ATCC9184梯度稀释样品，泳道11-15为肠炎沙门氏菌ATCC13076梯度稀释样品。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较 佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上 述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据 本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范 围内。
[0021] 实施例1禽源沙门氏菌多重PCR检测方法的建立 引物的设计:根据GenBank数据库中已有的肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙 门氏菌的基因组DNA序列，分析比对后分别筛选出上述三种血清型沙门氏菌的特异性基因 片段（SEQIDN0.1、SEQIDN0.4、SEQIDN0.7)，再此基础上设计、优选得到三种血清型沙 门氏菌的特异性检测引物，如下表所示。
[0022] 多重PCR检测引物组中肠炎沙门氏菌的扩增引物序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、 鸡伤寒沙门氏菌的扩增引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、鼠伤寒沙门氏菌的扩增引物 序列SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的完整SEQ序列如序列表中所示。