检测脱氧核糖核酸酶的dna探针、试剂盒和方法

文档序号:9882374阅读:1315来源:国知局
检测脱氧核糖核酸酶的dna探针、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶检测领域,具体而言,涉及脱氧核糖核酸酶的检测方法及一种脱氧 核糖核酸酶检测DNA探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 脱氧核糖核酸酶(DNase酶)普遍存在于细胞中,参与了多种生理生化过程,例如 DNA复制和修复、细胞凋亡等。其也可用作疾病的标志物,如在关节炎、肾炎患者体内,其DNA 酉每I表达水平低[Nadano,D. ;Yasuda,T. ;Kishi,K.Measurement ofdeoxyribonuclease I activity inhuman tissues and body fluids by a single radial enzyme-diffusion method.Clin.Chem.l993,39,448-452.];DNase酶也可用于疾病的治疗,如DNase I可用于 治疗囊性纤维瘤。
[0003] 传统的DNase检测方法包括高效液相色谱(HPLC)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等。 然而,这些方法普遍存在灵敏度不高,检测耗时,对仪器设备要求高等缺点。为解决上述问 题,比色法、电化学方法等技术被开发出来。比色法是基于DNase I裂解底物产生的短DNA片 段可被凝胶电泳或分光光度法检测,该法虽然操作简单、成本低,但灵敏度较低;在电化学 方法中,二茂铁基寡核苷酸被用于DNA酶检测;二茂铁是电化学活性的信号分子(Hillier, S.C.;Frost,C.G.;Jenkins ,A.T.;Braven,H.T.;Keay,R.ff.;Flower,S.E.;Clarkson, J . M. An electrochemical study ofenzymatic oligonucleotide digestion .Bioelectrochem 2004,63,307-310 ·),DNA酶I使二茂铁从电极释放,电流下降, 从而可利用伏安法检测DNA酶I活性。该法虽能达到较低的检测限,但其结果受电极修饰、操 作环境等影响大,难以作为一种常规的检测技术。
[0004] 在大量的研究和生产中,需要稳定的DNA分子,即DNA分子需处于无 DNase酶或对 DNase酶含量有一定限制的环境中,因此,对脱氧核糖核酸酶残留与否的检测就非常重要, 特别是急需一种简便、高灵敏、高通量的常规DNase含量检测方法,该检测方法可广泛用于 检测生物制品(如BSA)、试剂、表面环境(如实验台,容器、仪器表面等)中的DNase酶等,确保 研究的准确性和生产的稳定性。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的之一在于建立一种高灵敏度、高通量、简便常规的脱氧核糖核酸酶 检测方法,能准确地检测不同样本中不同脱氧核糖核酸酶的活性及含量。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种包含茎环结构的DNA探针,该探针可用于脱氧核 糖核酸酶定量检测。
[0007] 本发明的另一目的在于提供脱氧核糖核酸酶检测试剂盒。
[0008] 实现上述目的的技术方案如下。
[0009] 一种DNA探针,其包含有一个茎环结构,且2个末端或内部分别连接有能量供体基 团和能量受体基团,能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA探针的碱 基长度为15-50个核苷酸,且包含一个能被DNase切割的位点,被降解后的探针的能量供体 基团和能量受体基团在不同的探针片段上;
[0010] 所述茎环结构中,其茎结构包括位于探针两端的5~15bp的回文互补序列,其环结 构包括长度为5_20nt的核苷酸序列,探针退火后形成发夹结构,两个回文互补部分Tm值大 于 35°C。
[0011] 优选茎区至少包括1个T,2个T,3个T,4个T,5个T,6个T;和/或环区至少包括1个A、1 个C、1个T和1个G。
[0012] 在其中一个实施例中,所述DNA探针至少包括一个具脱氧核糖核酸酶抗性和/或提 高酶解特异性的修饰的核糖核苷酸。能防止DNA探针被酶降解的核苷酸修饰方式都可以,能 提高探针和酶反应的特异性修饰方式都适用本发明,优选核糖2-位修饰、磷酸骨架修饰。所 述磷酸骨架修饰具体为硫代磷酸酯修饰、二硫代磷酸酯修饰、磷酸三酯修饰等。所述核糖修 饰具体为2 ' -0-甲基核糖核苷酸、2 ' -F核糖核苷酸、2 甲氧基乙氧基核糖核苷酸、2 脱氧 核糖核苷酸、2'-0_烯丙基核糖核苷酸、2'-0_戊基核糖核苷酸或2'-0_ 丁基核糖核苷酸,更 优选为:所述DNA探针的末端的核糖核苷酸为硫代磷酸核糖核苷酸。
[0013] 在其中一个实施例中,能量供体基团为荧光基团,能量受体基团为其对应的荧光 淬灭基团。
[0014] 在其中一个实施例中,荧光基团和荧光淬灭基团选自FAM、TAMRA、HEX、CY染料、 BQH、Dabcyl〇
[0015] 在其中一个实施例中,所述DNA探针的碱基组成选自SEQ IDN0.1-SEQ IDN0.8任一 所示序列,也可以同时选择多条碱基组成如SEQ IDN0.1-SEQ IDN0.8所示序列构成的多条 探针。
[0016] 一种脱氧核糖核酸酶的检测试剂盒,包括有上述的DNA探针。
[0017] -种脱氧核糖核酸酶的检测方法,该方法包括以下步骤:1)制备如上述DNA探针作 为底物;2)将样本与步骤1)中所述底物接触;3)PCR荧光定量检测,检测步骤2)接触反应后 的底物的荧光强度。
[0018] 在其中一个实施例中,其步骤还包括在PCR荧光定量检测前反应体系中加入缓冲 液,所述缓冲液成分包括0.01 ~5M NaCl,0.01 ~5M KCl,50mM~1M Tris-HCl,10~100mM 皿区(:12,缓冲液的?11值6.5~9.0。优选0.3-2.51似(:1,0.2-211((:1,100111]\1-800111]\11^8-!1(:1, 20mM-100mM MgCh,优选500mM NaCl,200mM KCl,500mM Tris-HCl,100mM MgCl2,pH8.0。
[0019] 检测样本可为试剂、水、体液或包含DNase酶的任何液体样本或可配置为液体的样 本。
[0020] 优选DNA探针的浓度为0 · 01pmol/ul-10pmol/ul。优选的DNase酶为DNase I, Exonuclease I。
[0021] 本发明的方法基于荧光共振能量转移原理而建立:携带荧光基团和淬灭基团的寡 核苷酸发生共振能量转移(FRET),在加入DNA酶后,寡核苷酸底物被切割,荧光基团被释放, 荧光强度可代表DNA酶含量。一般来说,DNase含量越高,探针被降解得越多,PCR荧光信号更 强。
[0022] 本发明所述检测方法和检测试剂盒的体优势体现在:1)灵敏度高(可达0.0005U/ ul DNase I);2)特异性好(只对DNase有作用,对RNase没有作用);3)可高通量检测:能同时 对大量样本进行检测;反应体积小,成本低,简单快速(可在1小时完成检测),适宜实验室的 常规质控需求;4)可实时观测;5)广谱性:可检测不同样本中,不同脱氧核糖核酸酶的含量 和活性;6)安全:不使用任何有害化合物。
【附图说明】
[0023]图1实施例1中DNA探针的合成。
[0024] 图2实施例2中DNA探针对DNase检测结果示意图。
[0025]图3实施例3中DNA探针特异性检测结果示意图。
[0026] 图4实施例4中DNase I浓度梯度检测;其中,A为SEQ ID N0.7对不同浓度的DNase I进行检测的结果示意图;B为SEQ ID NO. 1-8对DNase I检测灵敏度的差异比较结果示意 图。
[0027] 图5实施例5中对Exonuclease I浓度梯度检测,其中,A为用SEQ ID N0.7对不同浓 度的Endonuclease I进行检测,B为8条探针对Endonuclease I检测灵敏度的差异的比较结 果示意图。
[0028] 图6实施例6中SEQ ID N0.7对商品酶的DNase活性测试的结果示意图。
[0029] 图7实施例7中SEQ ID N0.7对E.coli菌体裂解上清液中DNase活性的定量测定结 果示意图,其中RFU:相对荧光单位。
【具体实施方式】
[0030] 为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现,并不限于本文所描
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