一种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及华法林用药指导基因检测的引物探针组合及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 华法林是临床常用的一种适用于预防和治疗血栓栓塞性疾病的药物，是香豆素类 抗凝剂的一种，在体内有对抗维生素 K的作用。华法林可以抑制维生素 K参与的凝血因子Π 、 νπ、κ、χ的在肝脏的合成，起效后作用和维持时间较长。主要用于防治血栓栓塞性疾病。华 法林的剂量反应（国际标准化比值)关系变异很大，受许多因素的影响，一旦过量会导致出 血，因此需要严密监测。
[0003] 华法林的量效关系受遗传因素及环境因素的影响。遗传因素主要包括细胞色素 Ρ450基因位点的突变，肝酶对华法林S型异构体氧化代谢的活力。基因多态性已经被认为与 小剂量华法林引起较高的出血并发症的发生率相关。因此，在临床上对患者使用华法林的 剂量作出判断时，明确其基因多态性对制订治疗方案、分析预后非常重要。
[0004] 目前检测华法林用药相关基因遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原 理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其 变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切 不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽 管特异性有所提高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱， 引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法价格相对昂贵 且操作流程繁琐，在人类后基因组时代突飞猛进的今天，这几种方法均不能满足当前对华 法林用药相关基因遗传多态性快速准确分析的要求。因此，目前研发一种用于检测华法林 代谢相关基因的检测试剂盒十分迫切。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是:提供一种用于检测华法林用药相关基因分型的引物 探针组合及试剂盒。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于检测华法林用药相 关基因分型的引物，所述引物为如下列序列所示的引物对：
[0007]
[0008] 在本发明的第二方面，提供了一种用于检测华法林用药相关基因分型的探针，所 述探针为如下列序列所示的探针：
[0009]
[0010]在本发明的第三方面，提供了前述引物和探针在制备检测CYP2C9*3、VK0RC1和 CYP4F2多态性位点的试剂盒中的应用。
[0011] 在本发明的第四方面，提供了一种用于检测华法林用药相关基因分型的试剂盒， 其特征在于包括前述引物和探针;优选的，所述引物和探针用量为〇.5μ1。所述基因检测试 剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl 2和DEPC水等； 还可以含有标准品和/或对照品。
[0012] 在本发明的第五方面，提供了前述试剂盒在检测CYP2C9*3、VK0RC1和CYP4F2多态 性位点中的应用。
[0013] 术语"rs9923231、rs2108622"等，均是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号； CYP2C9*3等是对CYP2C9基因上一系列多态位点的另一种命名体系，如CYP2C9*3对应 rsl057910位点。
[0014]本发明的有益效果在于:通过临床研究证明了对华法林用药剂量有重大影响的3 个基因为0￥?209*3、0￥?4?2、￥1(01^1;通过华法林用药指导基因检测试剂盒的研制和应用， 可以使得CYP2C9*3、CYP4F2、VK0RC1这3个基因分型更加方便易行，同时保证无创诊断，为临 床医生快速准确掌握患者遗传情况，大大降低用药剂量不合适而引起的医疗事故发生率， 减轻用药副作用，为提高临床治疗效果奠定基础;检测速度快，每份样品检测仅需耗时约2 小时。
【附图说明】
[0015] 图1:本试剂盒所用Taqman Genotyping法与Sanger测序法结果比对。
[0016] (A)VK0RC1的结果比对图。
[0017] (B)CYP2C9*3的结果比对图。
[0018] (C)CYP4F2的结果比对图。
【具体实施方式】
[0019] -、华法林用药指导项目实验方法荧光定量检测
[0020] 步骤一:提取DNA
[0021] 将口腔拭子样本转移至1.5ml的EP管中，加入100μΙ Lysis Solution，混匀，95°C 加热3min，取出后放置室温，待温度降至室温，加入100μ1 DNA Stabilizing Solution，混 匀，放置4 °C保存。
[0022] 所用试剂：DNA Extract All Reagents(ABI)
[0023] 步骤二:配制试剂
[0024] 反应体系：
[0025]
[0026] 其中，正反向引物的浓度均为ΙΟμ mol/L，探针为20ymol/L。
[0027]步骤三：点板
[0028] 按照上述反应体系点板加样，每孔10μ1。加完后封膜，离心，排除气泡。
[0029] 所用耗材与仪器:MicroAMP Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode; MicroAMP Optical Adhesive Film;ABI 7900焚光定量分析仪。
[0030] 步骤四：上机
[0031] 将上述384孔板放入荧光定量分析仪，按照上样顺序编辑检测孔名称，设置荧光检 测通道，开始检测。程序如下：
[0032]
[0033] 步骤五:分析结果
[0034] 根据相应荧光通道的CT值判断分型结果。
[0035]二、实验结果
[0036]表1试剂盒检测结果同"金标准" Sanger测序法结果比对 [0037]
[00381
[0039]总体测序结果如表1所示，可以看到，运用本发明的试剂盒所用Taqman Genotyping法与"金标准"Sanger测序法结果比对，符合率为100%。
[0040]与Sanger测序法相比，运用本发明的试剂盒所用Taqman Genotyping法具有如下 优势：
[0041 ]表2本试剂盒方法同Sanger测序法优劣势比较
[0042]
[0043] 本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 序列表 <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <160>12 <210>1 <211>21 <2I2>DNA <213>人工序列 <400>1 GCjArmAGG CGTGAGCCAC €
[0044] <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <：16D>12 <210>2 <211>21 <212>DNA. <213>人工序列 <400>2 TCACAGACGC CACiAGGAAGA G <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <160>12 <2!0>3 <211>21 <212>DNA <2:13>人工序列 <400>3 (jCGACATGCC CTACACAGAT Q <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <160>12 <210>4
[0045] <211>27 <212>『)ΝΛ <213>人丄序列 <4004 GC，AGTGT/\fifi Λ(?;ΛΛ八(:ΛΛΛ(: ?ΤΛ( C ΤΤ <11?>常州杰傲病理诊断技术有限.公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <160>?2 <210>5 <2II>24 <2I2>DNA <213>人工序列 <400>5 GGAATGGACA AAAACAGAGA GAGG <11:0>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <Μ60>?2 <210>6 <2II>21 <M2>DN/\ <213>人工序列 <4006 GAGGGCTTCT CCTGACTGCT C
[0046] <110>常州杰傲病理冷断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基:因分型的别物探針组合及试.剂盒 <160>i2 <?」0'，/ <2.12>DNA 人工序列 <400>7 AGCCACCXiC 八（XCGGCC/、 <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林W药相关基因分型的引物探针俎合及试剂盒 <16012 <210>8 <21!>IS <2,12>DNA. <2丨3>人工序列 、400、8 AGCCACCGCA CCCGGCCA <?10>常州杰慠病理诊断技术有限公司 <120-种用Τ检测华法林用'蔚枏关基酉分型的引物探针组合及试剂盒 <16012 <210>9 <211>19 <2.12>DNA <213>人工序列
[0047] <400>9 TCCAGAGAIA GCTTGACCT <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <]_20>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <16012 <210>IQ <21!>19 <213>人工序列 <400>10： rt'CAGAGATA CATTGACCT <110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 20>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探-计组合及试剂盒 <160>12 <21011 <21!>15 <2：I2>DNA <213>人工序列 <4G0>11 TCCGGCCACA CAGCT
[0048] < 110>常州杰傲病理诊断技术有限公司 <120>-种用于检测华法林用药相关基因分型的引物探针组合及试剂盒 <16012 <210>!2 <211>15 <!12>DNA <213>人工序列 <40012 TCCGGCTACA' ΤΛ(?('Τ'
【主权项】
1. 一种用于检测华法林用药相关基因分型的引物，其特征在于所述引物序列如SEQ ID N0.1~SEQIDN0.6K*。2. -种用于检测华法林用药相关基因分型的探针，其特征在于所述探针序列如SEQ ID NO.7~SEQ ID NO. 12所示。3. -种如权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测CYP2C9*3、VK0RC1和CYP4F2多态 性位点的试剂盒中的应用。4. 一种用于检测华法林用药相关基因分型的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述 的引物和权利要求2所述的探针。5. 如权利要求4所述的用于检测华法林用药相关基因分型的试剂盒，其特征在于所述 引物和探针用量为〇 . 5μ1。6. -种如权利要求4或5所述的用于检测华法林用药相关基因分型的试剂盒在检测 CYP2C9*3、VK0RC1和CYP4F2多态性位点中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及华法林用药指导基因检测的引物探针组合及试剂盒。本发明提供了用于检测华法林用药相关基因分型的引物，引物序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.6所示；还提供了用于检测华法林用药相关基因分型的探针，探针序列如SEQ？ID？NO.7～SEQ？ID？NO.12所示。本发明的有益效果在于通过华法林用药指导基因检测试剂盒的研制和应用，可以使得CYP2C9*3、CYP4F2、VKORC1这3个基因分型更加方便易行，同时保证无创诊断，为临床医生快速准确掌握患者遗传情况，大大降低用药剂量不合适而引起的医疗事故发生率，减轻用药副作用，为提高临床治疗效果奠定基础；检测速度快，每份样品检测仅需耗时约2小时。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105648082
【申请号】
【发明人】李小龙
【申请人】常州市中医医院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月1日