一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因领域，涉及一种细菌的毒力基因筛选液相芯片试剂盒，具体 来说是一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌（SS)病是一种严重危害养猪业的人畜共患病，呈世界性分布。其中以1、 2、7、9型最为常见，主要的毒力因子有谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白（mrp)、胞外因 子(epf)、溶血素（sly)、纤连蛋白结合蛋白/纤连蛋白（fpbs)、毒力相关序列（orf2)、甘油 醛-3-磷酸脱氢酶。研究表明，SS致病性强弱与其毒力因子密切相关。其中mrp和epf是强毒 株的标志，sly为一种巯基活化类毒素，在菌体入侵和裂解细胞的过程发挥作用。其他独立 因子均与细菌的致病性有着密切的关系。
[0003] 目前，针对猪链球菌毒力因子筛选的方法主要是传统PCR方法，但此方法存在检测 效率低、敏感性不强、EB等核酸染色液存在污染等缺点，在筛选大量临床样本时工作量太 大。而且，目前使用的多重PCR筛选方法也只限于4种到5种猪链球菌毒力因子的筛选，已不 能满足对临床菌株毒力因子筛选的需要。随着科技的进步和技术的发展，急需建立一种能 同时检测更多毒力因子的高通量检测方法。近期，美国有报道采用液相芯片试剂盒技术方 法，通过一个反应孔同时对引起呼吸道感染的22种病原体(细菌和病毒)进行筛选，特异性 超过了97%，满足了临床中对呼吸道混合感染诊断的需要。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种猪链球菌7种毒力基因筛选 液相芯片试剂盒，所述的这种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒要解决现有技术 中检测猪链球菌毒力因子筛选方法工作量大、敏感性不强，而且污染严重的技术问题。
[0005] 本发明在于提供一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒，其含有：
[0006] 1)特异性的上游引物探针，所述的特异性的上游引物探针的序列如SEQ ID N0: 15-21所示；
[0007] 2)特异性的下游引物探针，所述的特异性的下游引物探针的序列为SEQ ID N0:2、 SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0 :12、SEQIDN0:l#；f 示，在任意一个所述的特异性下游引物探针的5'端加上了一段生物素；
[0008] 3)特异性微球，所述的特异性微球的序列如SEQ ID N0:22-28所示。
[0009] 进一步的，任意一个特异性上游引物探针中含有一段与微球相互补的TAG标签并 以12C相间隔。
[0010] 进一步的，任意一个所述的特异性微球的序列和对应的特异性上游引物探针中 TAG标签相互补。
[0011] 进一步的，还含有lXTm杂交夜、链霉亲和素。
[0012] 进一步的，还含有多重PCR Mix 1、多重PCR Mix 2,链球菌7个毒力因子筛选液相 芯片试剂盒使用说明书。
[0013] 本发明的用于猪链球菌7种主要毒力因子筛选液相芯片的试剂盒是一种高通量的 检测技术，集流式细胞仪技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一 体，是一种多功能的分析平台。液相芯片技术的准确性和特异性高，与普通PCR的符合率为 100%。与普通PCR检测相比，本试剂盒不仅具有高通量的优势，可在一个检测孔中同时对猪 链球菌7种毒力因子进行检测，且避免了EB对人的危害，灵敏度高，最低检测浓度可达到 lpg/yL〇
[0014] 本试剂盒采用多重PCR产物作为探针与特异性微球结合，提高了检测的特异性，通 过流式细胞仪和激光扫描技术，最终给出一个MFI值，不仅能够定性还可以对样本进行相对 定量。采用该试剂盒对临床猪链球菌毒力因子进行筛选，对于猪链球菌毒力的检测、流行病 学调查和风险评估具有重要的应用价值。
[0015] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。采用本发明的试剂盒进行猪链球 菌7种毒力基因筛选的液相芯片时，具有快速、高通量、敏感度高、特异性强等优点，极大的 缩短了实验周期，开拓了该试剂盒的应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1是液相芯片仪读取数据的原理图。
[0017] 图2是特异性探针与微球偶联的示意图及原理。
[0018] 图3是当微球在流动鞘液的推动下通过流式细胞仪，通过两束光对微球表面携带 的信息进行扫面和读取。
[0019] 图4是特异性PCR扩增产物在合适的杂交温度下，与特异性微球进行偶联。
[0020] 图5是运用本实验设计的多重PCR(组合1)对临床分离7株猪链链球菌扩增结图。
[0021] 图6是运用本实验设计的多重PCR(组合2)对临床分离10株猪链球菌扩增结果。 [0022]图7是验证液相芯片对猪链球菌毒力基因 EPF的最低检测浓度，当检测浓度稀释至 105fg/yL时，液相芯片显示的MFI为53。
[0023]图8是验证传统PCR对猪链球菌毒力基因 EPF的最低检测浓度，当检测浓度稀释到 Ing/yL时，电泳结果显示为阴性。
[0024]图9是用本试剂盒去验证临床分离的葡萄球菌、巴氏杆菌、猪丹毒、大肠杆菌、GPS 基因、EPF基因、阴性对照(分别对应样本1-7)结果显示前5个样本均无检测值。
[0025] 图10-16是运用本试剂盒对临床分离10株猪链球菌进行毒力基因筛选的结果。
【具体实施方式】
[0026] 下列实施例旨在进一步描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明 的精神和原则下，对本发明所作的本领或普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发 明的待批权利范围之内。
[0027]实施例1试剂盒设计原理
[0028]本发明首先设计了包括8(111，〇"2，1]1印，83口(111，;^^8,6口;^817在内的7种毒力因子 的特异性引物，利用DNAs tar设计，并送往上海桑尼合成。
[0029]特异性引物序列SEQ ID N0:l-14所示，然后送至上海桑尼生物科技有限公司合 成。先建立并优化好这7种引物(gdh，orf2，mrp，gapdh，fbps，epf，sly)各自的单重PCR检测 体系后，根据退火温度比较接近条带大小相距比较明显的原则进行组合分成两组，分别为 组 1 (fbps，gdh，orf 2，mrp)、组2 (s ly，gapdh，epf)，见图 5和图 6。
[0030]在前期多重PCR的基础上，在特异性上游引物5 '端加上一段TAG序列，中间用12个 碳桥作为终止信号，特异性上游引物见SEQ ID N0 15-21;特异性的下游引物探针的序列为 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID NO: 14所示，在任意一个所述的特异性下游引物探针的5'端加上了一段生物素。选择与 其TAG标签相互补的微球(带有Anti-TAG序列，SEQ ID N0 21-28)。用特异性探针引物去扩 增待检样本，然后取扩增后的PCR产物与微球杂交(见图2);将杂交后的混合液放入液相芯 片仪中进行读数，携带有微球的特异探针在鞘液流动的动力下通过流式细胞仪，同时机器 发出两道激光，红色激光通过对编码微球的识别来区别微球的编号，绿色激光用来识别下 游引物5 '链接的生物素作为报告基因定量(见图3 )，最终得出一个MFI值(以300作为阈值）。 [0031 ]表1本试剂盒建立多重PCR方法用到的标准菌株信息
[0032]
[0034] 实施例2试剂盒组成
[0035] 多重 PCR 试剂:PCR 体系 24.5yL
[0036] 组合 1(包含多重PCR Mix 12.541^，邙口8 4(111，〇"2，111印的引物各141^，(1(1!12〇841^)、 组合2(包含多重PCR Mix 12.5以1^，817 43口(111，印€的引物各叫1^，(1(