实时荧光定量pcr对川贝母的鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种对川贝母的鉴别方法，具体的说，实时荧光定量PCR对川贝母的鉴 别方法;属于化学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 川贝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品质较优，为百合科植物川贝母、棱砂、 乌花等的鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，药用价值较高。传统的川贝母的鉴别，主要 是性状、显微鉴别、光谱法，由于市场上贝母类药材品种较多，相同品种间也会因为药源植 物来源不一、种植环境、产地和加工等因素存在相当的混杂度，这就使得实验人员必须具备 较高的药材鉴别经验。随着分子生物学技术的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为 可能。目前文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法鉴别川贝母药材的相关报道。
【发明内容】
[0003] 针对上述不足，本发明的目的是提供一种通过磁珠法提取川贝母中的DNA，利用 PCR荧光探针法来鉴别，较普通PCR法操作简单、时间短、准确率高、环保。
[0004] -种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，依次包括下述步骤：
[0005] 1)引物的稀释
[0006] 每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解，于-20°C冰箱保存 备用；
[0007] 2)样品的前处理
[0008] 取lg试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中；
[0009] 3)DNA 的提取
[0010]样品的裂解:取前处理好的样品，加入400μ1裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A 5μ1，振荡混匀;置于70°C金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次;5000转离心10分钟， 取上清进行提取；
[0011] 4)磁珠法提取样品DNA
[0012] 取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μ1，连接缓冲液600μ1， 磁珠60μ1 ;F行加入清洗缓冲液Ι500μ1 ;G行加入清洗缓冲液Π 550μ1 ;Η行加入清洗缓冲液m 550μ1;取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μΙ;将混合后的96位深孔板和洗脱条，置 于核酸提取仪，进行DNA提取；
[0013] 5)PCR反应液的配制
[0014] 每管PCR管中分别加入2x荧光定量预混试剂彩色版10μ1、正、反引物各0.5μ1及无 RNA酶ddH20 7μ1;往上述含有反应液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使 反应液与DNA混匀，并经3000转离心3~10秒，立即进行PCR反应；
[0015] 6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95°C、4minl个循环;95°C、30s，60°C，30s，72 °C，60s，45个循环，采集荧光；
[0016] 7)数据处理
[0017]将数据同步至电脑上，选择"定性检测"对试样进行分析。
[0018] 进一步的，上述的一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，所述的荧光定量 PCR仪设置方法:检测模式为荧光通道，反应总体积为20μ1，染色选择荧光染色I，依次选择 预变性和三步扩增，收集荧光。
[0019] 与现有技术相比，由于传统的DNA提取多以试剂法提取，常因步骤多，往往提取效 率不高，以影响结果准确性;本发明采用磁珠法进行DNA提取，具有专属性强、富集效率高、 操作相对简单等特点。
[0020] 本发明对实时荧光定量PCR判定原则为无 Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指 数增长期，可判为非川贝母;Cq< 30,曲线有明显指数扩增期，可判为川贝母。
[0021] 本发明建立了用实时荧光定量PCR来鉴别川贝母，对5批川贝母和3批其它贝母类 进行了测试，通过Cq值和扩增曲线图来判断，直观明了，准确率100%，并经多次重复试验， 重现性好。说明该方法对于鉴别川贝母专属性强，可行性高，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0022]图1是川贝母对照药材、川贝母、阳性对照的qPCR检测结果。
[0023]图2是非川贝母类(平贝母、浙贝母和土贝母）、阴性对照的qPCR检测结果；
【具体实施方式】
[0024]下面结合【具体实施方式】，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对 本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围所做的有限次的修改，仍在本发明的 权利要求保护范围之内。
[0025] 实施例1
[0026] 1.材料与仪器
[0027] 1.1药材
[0028] 1.1.1川贝母对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121000-200405)川贝母 1、2来源于安徽亳州中药材市场，川贝母3、4和5、平贝母、浙贝母和土贝母来源于广西玉林 中药材市场，并经过形态学鉴定确认。
[0029] 1 . 1 . 2试剂和引物磁珠法植物DNA提取试剂盒（美国热电公司，批号： 00LSKFR804096F25N009)；
[0030] SuperReal荧光定量预混试剂增强版(天根生化科技有限公司，批号:03120);
[0031] 川贝母引物（invitrogen公司，批号：NS0_2954885,序列为：
[0032] 5，CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3，和
[0033] 5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'）。
[0034] 本发明所涉及到的百分浓度，没有特别说明的，液体均为体积浓度，溶质为固体的 指质量浓度。
[0035] 1.2仪器XA205DU电子天平(德国梅特勒托利多公司）、Minispin台式高速离心机 (德国Eppendorf)、MINIB-100F恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司）、LightCycler96焚光 定量PCR仪(瑞士罗氏公司）、Thermo Fisher Duo核酸提取仪(美国热电公司）。
[0036] 2 ·方法与结果
[0037] 2.1引物的稀释每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解， 于-20°C冰箱保存备用。
[0038] 2.2样品的前处理取lg试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管 中。
[0039] 2.3DNA 的提取
[0040] 2.3.1样品的裂解:取前处理好的样品，加入40(^1缓冲液和已融化的1?^86厶5以 1，振荡混匀。置于70 °C金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次。5000转离心10分钟，取 上清进行提取。
[0041] 2.3.2磁珠法提取样品DNA:取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品 300μ1，连接缓冲液r 600μ1，磁珠60μ1 ;F行加入清洗缓冲液Ι500μ1 ;G行加入清洗缓冲液Π 550μ1; Η行加入清洗缓冲液ΙΠ 550μ1。取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μΙ。将混合 后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取。
[0042] 2.4PCR反应液的配制每管PCR管中分别加入2x SuperReal PreMix Plus(DNA荧光 染料）10μ1、正、反引物各0·5μ1 及RNase-Free ddH20 7μ1。
[0043] 2.5PCR往上述含有反应液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使 反应液与DNA混匀，并经3000转离心3~10秒，立即进行PCR反应。
[0044] 2.6荧光定量PCR仪设置
[0045] 2.6.1方法设置:检测模式为荧光通道，反应总体积为20μ1，染色选择SYBR Green I，依次选择"Pre incubation"（预变性）和"3 Step Ampl if i cat ion"（三步扩增），选择 Single收集荧光。
[0046] 2.6.2qPCR反应参数按表1设置：
[0047] 表1 qPCR反应参数设置
[0048]
[0049] 2.7数据处理
[0050] 将数据同步至电脑上，选择"定性检测"对试样进行分析。
[0051] 2.8结果
[0052] 结果见表2，其中川贝母对照药材、川贝母1、2、3、4、5和阳性对照Cq值均〈30，且扩 增曲线有明显指数增长期，故可判定为阳性，见图1;而其它贝母类和阴性对照均无 Cq值，且 曲线均为一条直线，故为阴性，见图2。经过多次重复测试，样品结果稳定一致，表明该方法 对川贝母的鉴别准确率高、专属性强。
[0053] 表2样品的qPCR结果
[0054]
[0055] 引入了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性鉴别方法，但常规PCR存在需结 合电泳分析、无法对扩增反应进行实时检测，以及EB试剂有毒害性等缺点。而本发明采用的 实时焚光定量PCR探针法，具有以下特点:检测周期短 3小时以内、尚特异性 在延伸 中产生荧光需探针特异性与所检测基因的PCR产物配对、环保、高灵敏度、重现性好。
[0056] 本发明建立了用实时荧光定量PCR来鉴别川贝母，对5批川贝母和3批其它贝母类 进行了测试，通过Cq值和扩增曲线图来判断，直观明了，准确率100%，并经多次重复试验， 重现性好。说明该方法对于鉴别川贝母专属性强，可行性高，具有较好的应用前景。
【主权项】
1. 一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，其特征在于，依次包括下述步骤： 1) 引物的稀释 每管加超纯水〇.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解，于-20°C冰箱保存备 用； 2) 样品的前处理 取lg试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中； 3. DNA的提取 样品的裂解:取前处理好的样品，加入400μ1裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶Α 5μ1， 振荡混匀;置于70 °C金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次;5000转离心10分钟，取上 清进行提取； 4) 磁珠法提取样品DNA 取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μ1，连接缓冲液600μ1，磁珠 60μ1 ;F行加入清洗缓冲液Ι500μ1 ;G行加入清洗缓冲液Π 550μ1 ;Η行加入清洗缓冲液ΙΠ 550μ 1;取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液1〇〇μ1;将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核 酸提取仪，进行DNA提取； 5. PCR反应液的配制 每管PCR管中分别加入2x荧光定量预混试剂彩色版10μ1、正、反引物各0.5μ1及无 RNA酶 ddH20 7μ1;往上述含有反应液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应 液与DNA混匀，并经3000转离心3~10秒，立即进行PCR反应； 6) 设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95°C、4minl个循环;95 °C、30s，60 °C，30s，72°C， 60s，45个循环，采集荧光； 7) 数据处理 将数据同步至电脑上，选择"定性检测"对试样进行分析。2. 根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，其特征在于，所 述的荧光定量PCR仪设置方法:检测模式为荧光通道，反应总体积为20μ1，染色选择荧光染 色I，依次选择预变性和三步扩增，收集荧光。
【专利摘要】本发明提供了一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，旨在提供一种操作简单、时间短、准确率高、环保该方法依次包括下述步骤：1)引物的稀释备用；2)样品的前处理取1g试样；3)DNA的提取；4)磁珠法提取样品DNA；5)PCR反应液的配制；6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95℃、4min1个循环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环，采集荧光；7)数据处理；属于化学检测技术领域。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105648108
【申请号】
【发明人】陈学松, 罗达龙, 黄林杰, 黄琳
【申请人】广西壮族自治区梧州食品药品检验所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月15日