检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸 障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（Porcine Reproductive and Respirary Syndrome Virus，PRRSV)感染引起的，以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要 症状的传染病，临床症状主要表现为母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎、仔猪成活率下降和育 成猪呼吸道症状等。该病于1987年在美国首次出现，随后在世界各地迅速蔓延。
[0003] 猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)对养猪业造成了极大的影响，特别是北美和欧洲近年 来呈现全球蔓延的趋势，主要有母猪流产、生长期猪肺炎和仔猪死亡率增加等症状，因猪耳 朵呈蓝紫状，因此也被称为猪蓝耳病。在我国新出现一种高致病性蓝耳病，除了传统症状外 还可见体温明显升高，达41°C以上，皮肤发红、部分猪耳朵出血、淤血呈紫红色等症状，在一 个地区流行数月无明显好转，常规疗法无效。
[0004] 在1990年，美国的11个州和加拿大的11个州检测到这种病毒。接着1990年在德国 的明斯特地区发现报道，并且迅速的蔓延到德国的其它地区，这种病当时在德国被称为猪 感染晚期流产病（SSS)和地方流行性后期流产病(ESS)。其后在欧洲的其它国家(荷兰，法 国，比利时，英格兰和丹麦）相继出现。1990年晚期在北欧的猪场诊断出超过5000头患有此 病的猪。尽管这种疾病没有在意大利、波兰、瑞士和澳大利亚报道过，但是在意大利和波兰 的猪群中用抗体检测出PRRSV。
[0005] 这种疾病对经济的影响重大，造成了20-30%的猪死胎，每窝仔猪中损失1.5-2.0 只猪。在此疾病爆发时每头母猪上的损失达到250-500美元。在衣阿华州的一份报道中，100 英里内的农场中有85,330只死亡，并且造成1060万美元的损失。在西班牙，当PRRS第二次流 行时有近3000头猪被屠宰。2006年在中国发现高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，影响了超过2000 〇〇〇头猪。这种病毒对所有年龄段的猪都有影响，症状主要是高烧（高于41°C)、高致病率 (50-100%)、高死亡率(20-100%)。从2006年到2009年在中国的不同省份分离出了一大批 HP-PRRSV，并且和这种疾病的爆发相吻合。
[0006] 2015年，有学者报道在中国大陆出现一种新的类NADC30毒株。该类型毒株毒力较 强，造成爆发母猪流产、死胎以及仔猪呼吸道疾病（死亡率可达30%-50%)(Zhou L，Wang Z，Ding Y et al.NADC3〇-like Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，China[J].Emerg Infect Dis.20iroec;21(12):2256-2257·)。另外有学 者通过实验发现新出现的NADC30类毒株具有一定毒力，并且应用目前的防控措施较难控制 (Zhao K，Ye C,Chang XB et al. Importation and Recombination Are Responsible for the Latest Emergence of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in China[J].J Virol.20150ct 15；89(20):10712-6.)〇
[0007] 类NADC30毒株的出现给蓝耳病的防控提出了新的挑战。及时、准确的诊断对于疾 病的防控十分的重要，类NADC30毒株属于新发流行毒株，目前还未有该类型毒株的PCR诊断 方法。
【发明内容】
[0008] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明通过对猪呼吸与繁殖障碍综合症 基因组的分析，提供了一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法，该方 法可以对PRRSV经典、变异和新出现的类NADC30毒株进行快捷的鉴别区分。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0010] 一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物，所述引物如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0011] 上述检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物在制备检测猪呼吸与繁殖障碍综 合症病毒的试剂盒中的应用。
[0012] -种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
[0013] 在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括PrimeScript lstep Enzyme Mix，2 X 1step Buffer，和Rnase Free H2O〇
[0014] -种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的方法，采用上述引物，包括以下步骤：以 待检测样品的RNA为模板，进行RT-PCR扩增反应，电泳鉴定;所述RT-PCR扩增反应的反应体 系为： PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μ【 2x1 Step Buffer 12.5pL SE〇 ID NO:l 0.5"L
[0015] SEQ ID 職2 0,5pL 模板 Rinse Tice H〇Q 加至 25ftL.
[0016] 所述PCR扩增反应的反应程序为：50°C30min进行预变性;然后94°C2min，94°C30s， 55°C40s，共进行30次循环;最后72°C延伸lmin，72°C延伸lOmin。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
[0018] 1、本发明的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物具有很高的特异性和灵敏 度，能够检测出猪繁殖与呼吸障碍综合症的新型病毒类NADC30病毒；
[0019] 2、使用本发明的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物进行PCR扩增，可以通 过扩增片段的大小不同快捷的对PRRSV的经典株、变异株和类NADC30毒株这3类毒株进行鉴 别区分，省去测序的步骤，节省了时间和成本，操作简单、实用。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中对样品扩增的电泳图，其中泳道1为NADC30株，泳道2为经 典株，泳道3为类变异毒株，泳道4为样品A扩增结果，泳道5为样品B扩增结果，泳道6为阴性 对照；
[0021]图2为本发明试验例1的特异性检验结果，其中泳道1为经典株，泳道2为变异株，泳 道3为类NADC30毒株，4-9分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪 圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒，10为阴性对照；
[0022]图3为本发明试验例2的灵敏度检验结果，其中，泳道1、2、3、4、5、6、7代表的RNA浓 度分别为1 · 32yg、0 · 132yg、0 · 0132yg、1 · 32ng、0 · 132ng、0 · 0132ng、1 · 32pg。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0024] 以下实施例中涉及的实验材料如