一种蓝色发光上转换材料及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明创造属于免疫学、物理学、材料化学与分析化学领域，尤其是涉及一种蓝色发光上转换材料及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)是一类广谱抗菌药物，其具有价廉、使用方便等特点，在人类疾病治疗，兽医临床及动物饲料添加剂等研究领域中被广泛应用。但是近些年来，由于磺胺类药物的乱用和滥用，其在动物性食品中残留量超标现象越来越严重，食用这些食品后，人体可产生各种毒副作用，甚至造成器质性损伤。其毒性作用主要表现在致癌作用，引起过敏反应，抑制造血系统、使细菌产生耐药性，最终失去治疗人类疾病的作用等。
[0003]目前，磺胺类兽药残留检测方法主要有微生物抑菌法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)和酶联免疫方法(ELISA)等。其中高效液相色谱法是国际上通用的国标方法，具有灵活、通用、选择性强、检出限低等特点。但是其前处理方法繁琐，需要特定的仪器以及专业的人员操作，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，积极发展一种灵敏度高、快速、简便的药物残留检测手段势在必行。ELISA可有效避免仪器等因素的制约，但也存在一些缺点和不足，如干扰多、灵敏度不够等。为了解决这些问题，近年来，基于荧光的免疫方法受到了越来越多的关注。上转换材料有量子产率高、发射峰窄、较大的Stocks位移、化学稳定性好、毒性低的优点。由于没有自发荧光，信噪比和灵敏度大大提高，其在生物领域和临床应用上都具有诱人的前景。但还没有广泛用于检测食品中的磺胺喹噁啉。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明创造旨在提出一种可以定量的检测食品中的磺胺喹噁啉的简单、快速、灵敏的新型荧光免疫分析方法，通过荧光信号强弱的变化达到检测食品样品中的磺胺喹噁啉的目的。
[0005]本发明建立了一种以上转换荧光材料NaYF4:Yb ,Tm(激发波长为980nm，发射波长为477nm)标记磺胺喹噁啉单克隆抗体作为信号探针，磺胺喹噁啉包被原连接的聚苯乙烯磁性微球作为感应探针的竞争免疫法来检测食品中的磺胺喹噁啉的残留，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。
[0006]本发明的技术方案是这样实现的:
[0007]一种蓝色发光上转换材料，使用醋酸钇C6H17010Y，醋酸镱C6H906Yb.4H20和醋酸铥C6H9Tm.xH20为主要原料制备，得到的上转换材料发射波长为477nm。
[0008]—种制备上述蓝色发光上转换材料的方法，包括如下步骤:醋酸钇C6H17010Y，醋酸镱C6H906Yb.4H20和醋酸铥C6H9Tm.xH20按照79:19: 2的摩尔比例溶解在含有6ml油酸和17ml十八烯的三颈烧瓶中，加热到100°C抽真空反应lOmin，之后再加热到160°C并保持温度反应30min，冷却至室温;加入含有0.1g NaOH和0.148g NH4F的甲醇溶液，并加热到80°C，真空干燥30min，在氮气的保护下继续加热到300°C，冷凝回流lh，冷却至室温;最后用乙醇-环己烷将混合液离心清洗三次，即可得到蓝色发光油溶性上转换材料OA-UCNPs。
[0009]—种制备上述蓝色发光上转换材料的方法，包括如下步骤:(1)醋酸钇C6H17010Y，醋酸镱C6H906Yb.4H20和醋酸铥C6H9Tm.xH20按照70?90:15?25:1?2的摩尔比例与3?8ml油酸和10?20ml十八烯充分混合，先将混合液加热到80?100°C，抽真空反应1min以上，再将溶液加热到120?200°C，并保持温度反应20min以上，冷却至室温；加入含有0.1gNaOH和0.148g NH4F的甲醇溶液，充分搅拌混匀，除去甲醇溶液再将混合液在惰性气体保护下加热到280?320°C，反应I?3h，冷却至室温;最后用有机溶剂清洗三次，即可得到蓝色发光油溶性上转换纳米材料。
[0010](2)0.2?0.5g聚丙烯酸溶解在5?35ml乙二醇中，在氮气保护下加热到110°C，之后注入步骤(I)制得的10?200mg油溶性上转换材料与I?20ml甲苯的混合液，保持反应0.5?2h ；继续加热到200?300 °C，反应0.5?2h;反应结束加入过量的稀盐酸，得到白色粉末，再用超纯水清洗，即可获得水溶性的上转换材料PAA-UCNPs。
[0011 ] 一种制备得到的水溶性的上转换材料的应用:
[0012]采用活化酯的方法将磺胺喹噁啉单克隆抗体连接到水溶性上转换材料上以制备免疫荧光信号探针，具体方法如下:(I)免疫荧光信号探针:称取5mg PAA-UCNPs超声分散在2ml 0.0lmol L_l，pH 5.5的一水吗啉乙磺酸(MES)溶液，按照摩尔比例1: 1.2加入EDC和NHS，30 °C下反应2h;用0.0 ImoI L-1，pH 7.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液清洗三次，加入磺胺喹噁啉单克隆抗体反应2h，再用BSA溶液封闭2h，即可获得免疫荧光信号探针；
[0013](2)免疫感应探针制备:向含有5mg核壳式单分散聚苯乙烯磁性微球(MMPMs)的I3BS溶液中加入EDC和NHS，室温下活化2h，PBS清洗三次，加入25yg磺胺喹噁啉包被原，室温下反应4h。用2%BSA封闭，PBS磁分离清洗三次，得到的复合物即为免疫感应探针；
[0014](3)免疫荧光信号探针和免疫感应探针，建立荧光免疫竞争体系:
[0015]取1.5ml的小试管若干个，分别加入10yL的免疫感应探针和10yL免疫荧光信号探针，配制浓度梯度O、0.1、0.5、1、5、10、50、10ng mL-Ι的磺胺喹噁啉标准品溶液，然后依次向每个小试管中加入游离的磺胺喹噁啉标准品溶液，室温下反应Ih;反应结束后，在外加磁场作用下分离结合产物，并用PBS清洗3次；用600yL PBS复溶后，放入到F-4500荧光分光光度计上进行荧光测定。
[0016]本发明的优点和积极效果是:
[0017](I)本发明提供的发射蓝色荧光上转换材料合成方法简便易行，合成的材料有荧光强度高、量子产率高、生物相容性好、毒性低和没有自发荧光的优点。该材料用化学合成方法制备，有较高的稳定性、较长的使用寿命。
[0018](2)本发明提供的快速检测方法结合磁分离技术的应用，操作简便快速。
[0019](3)本发明提供的快速检测方法具有较好的灵敏度，样品检测限可达到0.5ng mL一、特别是牛奶样品比市售商业化试剂盒(5ng mL—O的检测限低10倍。
[0020](4)本发明提供的快速检测方法不适用有机提取剂，绿色环保。
[0021](5)本发明使用上转换材料建立荧光免疫分析方法，可是降低背景机制的影响，使得样品前处理简单，简化操作步骤。
【附图说明】
[0022]图1为本发明的荧光免疫方法检测磺胺喹噁啉的示意图；
[0023]图2为本发明的荧光免疫检测标准曲线；
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施来限定本发明的保护范围。
[0025]本发明是使用热分解的方法，合成发射蓝色荧光的上转换纳米材料(激发波长980nm，发射波长477nm)，将制备的材料用于标记磺胺喹噁啉单克隆抗体作为荧光信号探针，磺胺喹噁啉包被原修饰的聚苯乙烯磁性微球制备的免疫感应探针，与反应系统中游离的磺胺喹噁啉形成荧光免疫竞争体系用于检测食品样品中残留的磺胺喹噁啉。
[0026]其具体实施例为:
[0027]实施例1水溶性上转换荧光标记材料的制备
[0028]通过热分解的方法制备上转换纳米材料，具体方法如下醋酸钇C6H17OiqY,醋酸镱C6H9O6Yb.4H20，醋酸铥C6H9Tm.XH2O按照79:19:2的比例溶解在含有6ml油酸(OA)和17ml十八烯的10ml的三颈烧瓶中，加热到100°C真空干燥10分钟，之后加热到160 V，反应30分钟，冷却到室温。含有Na0H(0.1g)和NH4F(0.148g)的甲醇溶液被加入三颈瓶中，混合溶液加热到80°C真空干燥半个小时。在氮气的保护下，混合溶液被加热到300°C冷凝回流保持一个小时，冷却到