使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及从人多能干细胞例如人胚胎干细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖 细胞的方法。
[0002] 发明背景 0细胞移植潜在地提供了 I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了 该治疗作为临床治疗的用途。
[0003] 多能干(PS)细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，1?细胞为有希望的β细 胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可重复地分化为膜β细胞。在脊 椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生Ξ个胚层:外胚层、中胚层和内胚层。
[0004] 对于形成内胚层衍生组织例如膜组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步。从DE细 胞产生膜内胚层(ΡΕ)为产生产膜岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞化Ρ)潜能 的ΡΕ细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和ΝΚΧ6.1的共表达。
[0005] 对于从PS细胞产生膜细胞已经建立了分步体外分化方案。
[0006] 运些方案一般模拟膜发育的主要事件，其包括几个阶段例如DE、原肠、后前肠、ΡΕ、 ΕΡ和最后完全分化的膜β细胞的形成。
[0007] -些科学论文中描述的方案例示了用于从人胚胎干化ES)细胞和诱导多能干 (iPS)细胞获得膜(-样)细胞的方案(Aoi等2008; D'Amour等2006; Jiang等2007; Kroon等 2008; Takahashi等2007; Takahashi & Yamanaka 2006;和Wernig等2007)。
[000引迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A和Wnt处理实现。DE细胞可使用 视黄酸（RA) (Cai等2010; D'Amour等2006)和BMP抑制剂化unisada等2012; Schulz等 2012; Zhang等2009)进一步分化为阳细胞。
[0009] 在产生膜β细胞的途径中产生阳细胞之后的下一个步骤为产生表达NGN3和NKX2.2 标志物的ΕΡ细胞。
[0010] Nostro等（2012)和Kunisada等（2011)描述了用于将阳分化为ΕΡ的方法。
[0011] 然而，存在对更有效的将PE分化为EP的方法的需求。
[0012] 发明概述 本发明提供改进的用于通过组合已知方案的特征从而增加 NGN3/NKX2.2双阳性细胞的 百分比将膜内胚层(PE)分化为内分泌祖巧P)细胞的方法。通过向前述方法添加小分子所述 百分比可进一步增加。小分子的某些组合允许NGN3/NKX2.2双阳性百分比的进一步有利增 加。
[0013] 本发明进一步设及通过本发明方法可获得的EP细胞。
[0014] 本发明进一步设及所述细胞尤其在治疗I型糖尿病中的医学用途。
[0015] 本发明采用一种替代方法W改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通 过提供增加 NGN3/NKX2.2双阳性细胞化Ρ细胞定型为内分泌细胞命运的标志物)百分比的方 法。
[0016] 在一个实施方案中，本发明提供改进的膜β细胞前体群，即，NGN3/NKX2.2双阳性细 胞的百分比增加的EP细胞。
[0017] 在另一个实施方案中本发明提供更均质的EP细胞群，运对于运些细胞向完全分化 的膜β细胞进一步发育是重要的。
[0018] 在另一个实施方案中，本发明还提供更同步的ΕΡ群，W到达分化的下一阶段，即葡 萄糖响应的完全分化的β细胞。
[0019] 在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将 包含膜内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的TGF-β I型受体抑制剂和BMP括抗剂和 腺巧酸环化酶激活剂和烟酷胺。
[0020] 在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将 包含膜内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。
[0021] 本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
[0022] 附图简述 图1显示本发明方法在NGN3 mRNA诱导中的有利作用。
[0023] 图2显示本发明方法在产生NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞中的有利作用。
[0024] 图3显示组合本发明小分子的个体作用和有利作用。
[0025] 图4显示组合本发明几种小分子的个体作用和有利作用。
[0026] 发明详述 本发明设及从人源的多能干细胞例如胚胎干化S)细胞和诱导多能干细胞产生内分泌 祖化P)细胞的方法。
[0027] 干细胞为通过其在单细胞水平自我更新且分化产生子代细胞(包括自我更新祖细 胞、非更新祖细胞和终末分化细胞)的能力而界定的未分化细胞。干细胞特征还在于其体外 从多胚层（内胚层、中胚层和外胚层)分化为各种细胞谱系的功能细胞W及移植后产生多胚 层的组织的能力。
[00%]干细胞按照其发育潜能分为：（1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚外细胞类 型；（2)多能的（pluripotent)，意指能够产生所有胚胎细胞类型；（3)多潜能的（multi- potent)，意指能够产生细胞谱系的子集，但所有均在一种特定组织、器官或生理系统内（例 如，造血干细胞可产生的子代包括HSC (自我更新）、血细胞限制的寡能的祖细胞和为血液 正常组分的所有细胞类型和成分(例如，血小板））；（4)寡能的，意指能够产生比多潜能干 细胞更受限的细胞谱系子集;和(5)单能的，意指能够产生单细胞谱系（例如，产生精子的 干细胞）。
[0029] 成熟或分化的膜细胞的确不增殖而的确分泌高水平的膜内分泌激素或消化酶。例 如，完全分化的β细胞响应葡萄糖而分泌高水平的膜岛素。当细胞丧失未分化细胞的标志物 或获得分化细胞的标志物时，出现细胞相互作用变化和成熟。丧失或获得单个标志物可指 示细胞已经"成熟或完全分化"。
[0030] 本发明采用一种替代方法W改进人ΡΕ细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通 过提供增加 NGN3/NKX2.2双阳性细胞百分比的方法，所述NGN3/NKX2.2为ΕΡ细胞群的标志 物，所述ΕΡ细胞群是到达产膜岛素膜β细胞所必需的细胞阶段之一。
[0031] 此外，本发明提供更均质和同步的ΕΡ细胞群，运对于运些细胞向产膜岛素的β细胞 进一步发育是重要的。
[0032] 本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
[0033] 如本文所使用的，"产膜岛素细胞"指响应葡萄糖产生和储存或分泌可检测量的膜 岛素的细胞。"产膜岛素细胞"可为单个细胞或细胞集合。
[0034] 如本文所使用的术语"β细胞"指位于膜内称为膜岛的小细胞簇中的细胞。β细胞通 过分泌肤激素膜岛素响应高血糖水平，所述肤激素膜岛素作用于其它组织W促进从血液吸 收葡萄糖，例如在肝脏中，其中其促进能量经由糖原合成而储存。
[ΟΟ%] 如本文所使用的。分化(differentiate)"或分化''(differentiationΓ指细胞从 未分化状态发展至分化状态，从不成熟状态发展至较不成熟状态或从不成熟状态发展至成 熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎膜细胞能够增殖和表达特征标志物，如PDX1、 ΝΚΧ6.1和PTFla。
[0036] 术语"分化因子"指加至ES-或膜前体细胞W促进其分化为EP细胞的化合物。分化 因子还可驱使进一步分化为成熟β细胞。
[0037] 示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒姗外泌肤 (exendin)-4、碱性成纤维细胞生长因子、膜岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因 子、血小板衍生生长因子、膜高血糖素样肤1、吗I噪内酷胺VGndolactam VXIDE1&2和视黄 酸。
[0038] 在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
[0039] 在一个实施方案中本发明设及向在其产物中缺乏至少一种膜激素的哺乳动物提 供膜内分泌功能的方法，所述方法包括植入足W在所述哺乳动物中产生可测量的所述至少 一种膜激素的量的通过本发明的任何方法获得的细胞的步骤。
[0040] 在一个实施方案中，根据本发明方法制备的EP细胞群可用于，例如通过植入需要 此种治疗的患者中治疗糖尿病。
[0041] 如本文所使用的，术语"人多能干化PS)细胞"指可从任何来源衍生的并且能够在 适当条件下产生人不同细胞类型（其为所有3个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物） 子代的细胞。hPS细胞具有在8-12周龄SCID小鼠中形成崎胎瘤的能力和/或在组织培养物中 形成所有Ξ个胚层的可鉴别细胞的能力。人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细 胞，包括文献中人胚泡衍生的干化BS)细胞(常称作人胚胎干化ES)细胞）。
[0042] 本文中描述的各种方法和其它实施方案可能需要或利用多种来源的hPS细胞。例 如，适用的WS细胞可从发育的胚胎获得。另外或替代地，合适的WS细胞可从已建立的细胞 系和/或人诱导多能干化iPS)细胞获得。
[0043] 如本文所使用的术语细胞"指人诱导多能干细胞。
[0044] 如本文所使用的，术语"胚泡-衍生的干细胞"标记为BS细胞，并且人形式称为"hBS 细胞"。在文献中该细胞常常被称为胚胎干细胞，更特别为人胚胎干细胞化ESC)。本发明继 而使用的多能干细胞因此可为从胚泡制备的胚胎干细胞，如例如W0 03/055992和W0 2007/ 042225中所述，或可为市售可得的hBS细胞或细胞系。然而，进一步设想本发明继而可使用 任何人多能干细胞，包括分化成体细胞，其通过例如用某些转录因子例如0CT4、S0X2、NAN0G 和LIN28处理成体细胞而重编程为多能细胞。
[0045] 如本文所使用的/'EP细胞群"为其中至少