用于细胞检测和分离的微流体分拣器的制造方法
【专利说明】用于细胞检测和分离的微流体分拣器
【背景技术】
[0001]传统宏观细胞分离方法包括:采用膜类过滤器的物理过滤法；以及利用细胞大小、 变形性及密度差异过滤出目标细胞的密度梯度离心法。这些技术均为劳动密集型工艺，而 且需要实施多步骤的样本制备过程。这些过程可能引入人为现象，或者导致所需细胞的损 失。此外，膜过滤方法易发生堵塞且需要频繁清理。另外，已有报告证明，经过滤及离心技术 处理的目标细胞的原始表现型会发生机械应力所致变化。
[0002] 因此，很显然地，需要开发更加简单有效的血样处理技术，以减小细胞损失并为后 续分析保持目标细胞的原始表现型。
【发明内容】
[0003] 微流体在长度上具有较小尺寸，因此可在血液分离过程中实现更佳的细胞微环境 控制，从而极其适用于初步血样处理。许多研究组已展示了芯片内血液分析法在红细胞 (RBC)变形性研究、血小板和血浆分离、白细胞分离、以及血液中循环肿瘤细胞(CTC)或胎儿 细胞等罕量细胞的分离等不同方面的应用。然而，这些微流体系统因主要限制于样本稀释 或流量较低造成的低处理量，而不适合处理体积通常为数毫升的临床血样。本文描述了可 克服上述问题的微流体装置。
[0004] 在本发明的第一种具体表现形式中，提供一种检测个人样本中的一种或多种循环 肿瘤细胞(CTC)的方法，包括:将所述样本导入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装 置包括一个或多个螺旋形通道，其中，每个通道具有长度和截面，所述截面的高度和宽度定 义了适于根据细胞大小沿所述通道截面各部分分离循环肿瘤细胞的高宽比；当所述循环肿 瘤细胞存在时，该细胞则沿所述通道的径向最内部分流至第一出口，而所述样本中的其他 细胞沿所述通道的另一部分流至第二出口，从而检测出所述个人样本中的一种或多种循环 肿瘤细胞。
[0005]各实施方式可具有许多优点，包括:在较高流量下连续运行而不使样本发生化学 改性，从而实现更快的临床样品处理速度，并减少处理时间和成本；以及/或者收集活细胞， 用于后续生物测定。
【附图说明】
[0006] 以下，通过对附图展示的例示实施方式进行更加具体的描述，上述内容将变得容 易理解。各附图中，类似附图标记指代相同部件。各附图并非一定按比例绘制，相反，其重点 在于对实施方式进行说明。
[0007] 图1A和图1B为具有单入口和八等分出口（标为1~8)的PDMS制螺旋形CTC分离微通 道(该微通道内填有可视化染料)的照片。图1A还示出了所述螺旋形微通道出口部分的显微 图像。
[0008] 图2为CTC分离螺旋形分拣器的示意图。在入口处，血液细胞(RBC、白细胞以及CTC) 随机分布于微通道截面上。在惯性升力和迪恩祸(Dean vortices)的影响下，这些细胞根据 大小，在所述截面的不同位置处达到平衡，其中，较大的CTC在最靠近微通道内侧壁处达到 平衡。其后，利用所述八个均匀间隔的出口提取各个细胞流，从而实现分离。
[0009]图3为本发明超高处理量CTC分离芯片的工作原理示意图。其中，全血经该装置的 内侧入口栗送，而鞘液经外侧入口输入。在迪恩拖曳力的影响下，较小血液细胞(RBC和WBC) 因所述曲线形通道的几何形状而随两个反向旋转涡流(剖面图）朝通道外侧壁迀移。此外， CTC因其较大的尺寸而承受较强的惯性升力，该力使得CTC沿所述微通道内侧壁达到平衡， 从而实现分离。
[0010]图4A和图4B为表明所述螺旋形微通道出口处的RBC、白细胞和CTC的平均合成图像 4A和扫描曲线图4B。如图所示，血液细胞(RBC和白细胞)在迪恩拖曳力的影响下转移至通道 外半部分，而较大的CTC在惯性升力的影响下在通道内侧壁附近发生聚集。
[0011] 图5包括根据一种实施方式的微流体装置曲线形通道俯视图5a~5d，以及利用半 迪恩周期细胞分离原理分离细胞的相应方法示意图。
[0012] 图6包括根据另一实施方式的微流体装置螺旋形通道俯视图6a~6d，以及利用单 全迪恩周期原理分离细胞的相应方法示意图。
[0013] 图7为图5a或图6a中用于将CTC与样本中其他细胞分离的微流体装置的制造方法 流程图。
[0014] 图8a所示为根据另一实施方式的本发明生物芯片俯视图，该生物芯片设有微通 道，该微通道具有两个相对并联设置的曲线形部分。
[0015] 图8b所示为具有阻尼器822的单个圆弧部分820。
【具体实施方式】
[0016] 各实施方式可总体涉及微流体装置，以及该装置用于从含有两种或更多（多种)细 胞类型（如细胞集合或细胞混合物）的样本中检测和/或分离出一种或多种特定类型细胞 (如待检测和/或待分离的目标细胞）的用途。具体而言，本发明可用于许多将细胞/颗粒分 离的高分辨率和高处理能力作为重要要求的环境及生物用途。更具体地，下述实施方式涉 及具有简单曲线形微通道几何形状的微流体装置，所述几何形状用于实现基于尺寸和惯性 的细胞/颗粒分离。所述微流体装置包括用于引入所述样本的一个或多个入口，一个或多个 样本流经通道，以及一个或多个出口，通常为至少两个出口，其中，样本中的待检测和/或待 分离细胞流经所述出口中的一个出口（如第一出口），样本中的其余细胞不与待分离细胞流 经同一出口，而是/或者流经另一(不同）出口（如第二出口）。所述一个或多个通道中的每个 通道均具有长度和截面，所述截面的高度和宽度定义了适于沿所述通道截面的至少一部分 分离所述目标细胞的高宽比，其中，所述目标细胞沿每个通道的第一部分流至第一出口，而 其余细胞沿每个通道的第二部分流过，而且不与所述目标细胞流经相同出口，并且/或者流 经一个或多个(不同，如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八等）出口。
[0017] 如本文所述，所述微流体装置可具有一个或多个(至少一个)入口，用于将所述样 本导入该装置中。举例而言，所述装置可具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八 个、九个、十个等入口。
[0018] 所述样本可采用本领域技术人员已知的各种技术导入所述装置中。举例而言，所 述样本可由注射器和/或栗导入所述装置中。
[0019] 同样地，所述微流体装置可具有一个或多个出口。在某些方面，所述装置可具有一 个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等出口。在一个具体方面，所述装置 具有至少两个出口。在另一方面，所述装置具有三个出口。在另外一方面，所述装置具有四 个出口。在其他方面，所述装置具有八个出口。
[0020] 所述装置还包括将所述一个或多个入口连接至所述一个或多个出口的一个或多 个通道(例如平行通道，如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等平行 通道）。所述各通道包括截面，该截面的高度和宽度定义了可将目标细胞与样本中其余细胞 分离的高宽比。本文中，高宽比是指通道高度除以其宽度之比，该高宽比为所述通道提供了 合适的截面，以使目标细胞沿该通道截面的至少一部分流至第一出口，而其余细胞则沿该 通道的不同（如第二、第三、第四等）部分或截面流动，从而不与所述目标细胞流至相同出 口，而是流至不同（如第二、第三、第四等）出口。所述合适高宽比使得样本中的目标细胞根 据其结构特征与样本中其余细胞的相同或相似结构特征之间的差异，流经所述通道的不同 部分。此类结构特征例如包括细胞大小、刚性、变形性、黏附性（如细胞黏附性)等。举例而 言，如本文所示，可采用1、2.5、3.75、5或7的高宽比。
[0021] 在一个具体方面中，所述通道为一螺旋。举例而言，所述螺旋形通道的高度处于约 1 Ομπι和约200μηι之间的范围内，例如约100μπι和约140μηι之间。所述螺旋形通道的宽度可处于 约100μπι和约500μηι之间的范围内。所述螺旋形通道的长度可处于约1 cm和约100cm之间的范 围内。
[0022] 所述样本可以各种流量流经所述微流体装置，例如生理流量(如小动脉生理流量） 或非生理流量。例示流量包括约2千万细胞/分钟，或处于约2.5毫升/分钟和约5微升/分钟 之间的范围内。
[0023]本文所述微流体装置可用于从细胞样本中检测、分离和/或离析目标细胞。所述细 胞样本可例如为血液(例如全血）、血浆、腹水、淋巴、髓液、尿液、组织等生物样本。所述样本 还可以为细胞培养样本。在一个具体方面，所述样本为血液样本(例如全血样本）。所述血液 样本具有低的红细胞比容(例如约1~10%)，或高的红细胞比容(例如约20~50%)。
[0024] 血液为一种复杂的细胞血浆悬浮液(细胞约占血液体积的40~45% )，而且起到包 括向细胞运输氧气和营养、移除细胞废液以及提供免疫保护在内的若干关键作用。红细胞 (RBC)占所有血液细胞组分的>99 % (每毫升全血约有5 X 109个RBC)，其余的〈1 %由外周血 白细胞(PBL)和血小板组成。由于其复杂特性，采用微流体生物芯片分析血液一直是一个难 题。除了RBC和白细胞之外，在患者外周血中还存在胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、 干细胞以及白血病细胞等低丰度细胞，这些细胞可用于患者监测、疾病诊断、治疗监测以及 实施基础科学研究等各种生物医学应用。然而，由于这些细胞数量极其稀少，因此在几乎所 有分析之前，均需要实施富集或分离步骤，以从血液中有效地分离出此类细胞。
[0025] 由此可见，本文所述的一个或多个微流体装置(例如以并联或串联等方式级联的 微流体装置)可用于各种目的，而且在一个方面，可用于各种目标细胞的检测、分离和/或离 析。各种目标细胞均可被检测出。可检测出的目标细胞例如包括病变细胞(如被疟疾感染的 红细胞、白血病红细胞、镰状细胞贫血红细胞或其组合，非同步混合物中的同步细胞，以及 循环肿瘤细胞(CTC)等病变血细胞）。
[0026] 在另一方面，所述微流体装置可用于循环肿瘤细胞的检测、分离和/或离析。在所 有癌症相关死亡中，癌症转移以及肿瘤形成所带来的致命性后果约占90 %。具体而言，在癌 症转移患者的外周血中，已发现了活的肿瘤衍生上皮细胞，即所谓的循环肿瘤细胞或CTC。 这些CTC负责外渗至较远的器官，以形成新的转移位点，从而将癌症扩散。临床报告显示， CTC的存在数目通常与疾病阶段相关，而且可用作预后指标。除了上述在预后方面的意义，