金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药用图

文档序号:10619998阅读:1156来源:国知局
金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明属医药技术领域,具体涉及一种哈萨克药金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤药物中的应用。本发明的提取物通过如下方法制备:哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:1-100:6,体积比)洗脱,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:8-100:30,体积比)洗脱,石油醚:丙酮100:8-100:30洗脱液干燥后即得。
【专利说明】
金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药用途
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域,具体涉及一种哈萨克药金莲花抗肿瘤提取物及其组合物 的制备方法和其在制备预防及治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、脑胶 质瘤等恶性肿瘤药物上的用途。
【背景技术】
[0002] 本品是毛茛科金莲花属的植物,学名:Trollius chinensis Bunge。一年生或多年 生草本。株高30 - 100厘米。茎柔软攀附。叶圆形似荷叶,花形近似喇叭,萼筒细长,常见 黄、橙、红色。有变种矮金莲,株形紧密低矮,枝叶密生,株高仅达30厘米,极适宜盆栽观赏, 花期2 - 5月。是很好的装饰用花卉,也可构成窗景。
[0003] 金莲花具药用功能,可清热解毒,主治扁桃体炎、中耳炎。用于急、慢性扁桃体炎, 急性中耳炎,急性鼓膜炎,急性结膜炎,急性淋巴管炎。
[0004] 本发明通过系统地筛选研究,意外地发现金莲花提取物具有显著抗肿瘤活性,即 金莲花提取物对乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的 具有很好的预防及治疗作用,可以应用于癌症的预防和治疗。
[0005] 但是,对其抗肿瘤的有效成分一直不清楚,本发明通过系统地筛选研究,发现了金 莲花的有效提取提取物,可以应用于肿瘤的预防和治疗。

【发明内容】

[0006] 本发明所解决的技术问题是提供一种金莲花提取物。
[0007] 本发明还提供了以金莲花提取物为主要活性成分的组合物。
[0008] 本发明同时提供了金莲花提取物及其组合物的制备和制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明是通过如下技术方案实现的:
[0010] 哈萨克药金莲花经有机溶剂(优选甲醇)超声提取,提取液浓缩后,用硅胶SiO2 柱分离,上样后的硅胶柱,用石油醚:丙酮混合溶剂(1〇〇 :0-0 :1〇〇)梯度洗脱(石油醚:丙 酮,具体比例见表1),各石油醚:丙酮比例混合溶剂洗脱液,浓缩,干燥后,利用体外抗肿瘤 活性筛选体系测试其抗肿瘤活性,意外地发现先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮, 100 :1-100:6,体积比,优选100 :4-100 :6)洗脱,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙 酮,100 :8-100:30,体积比)洗脱,石油酿:丙酮100 :8-100:30洗脱液干燥后,具有显著地 抗肿瘤活性。优选地,先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比,继用石油 醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱,石油醚:丙酮100:30洗脱液干燥 即得,本发明的抗肿瘤活性的化合物,可以通过以上方法,得到富集,从而与其他杂质类成 分分离开。该活性提取物从未见文献报道,其100:30洗脱液的TLC分析表征如图1。色谱 条件为GF 254硅胶板,展开系统是石油醚:乙酸乙酯:丙酮=3:1: 1,香草醛浓硫酸显色。
[0011] 具体,发现过程如下:
[0012] 1、金莲花经甲醇超声提取物的制备
[0013] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL甲醇超声提取15min,提取液浓缩后,得提取物 SN0244A :1. 9763g 留样 0· 0980g、0. 0989g 剩余 I. 7794g
[0014] 2、石油醚:丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果
[0015] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL甲醇超声提取15min,提取液浓缩后,得提取物 SN0244A :1. 9763g 留样 0. 0980g、0. 0989g 剩余 I. 7794g。上柱,甲醇溶解,共用甲醇 15ml。 上硅胶柱色谱,拌样硅胶2. 5g,空白硅胶10g,玻璃柱内径1.8cm,石油醚:丙酮系统梯度洗 脱(石油醚:丙酮,体积比,见表1),柱体积25ml,每个梯度洗脱200ml,得到,各个浓度提取 洗脱液的洗脱物,回收溶剂,即得,石油醚:丙酮梯度洗脱提取物,TLC分析结果见图2,图3。 色谱条件为GF 254硅胶板,展开系统是石油醚:乙酸乙酯:丙酮=6:1:1,石油醚:乙酸乙酯: 丙酮=3:1:1,香草醛浓硫酸显色。
[0016] 表 1
[0019] 3、抗肿瘤活性筛选方法和结果
[0020] 1)实验条件
[0021] a)细胞株信息
[0022] 人乳腺癌细胞株MCF7购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0023] b)药品及试剂
[0024] 样品无菌条件下,DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL,使用时用RPMI-1640培 养液稀释至所需浓度(DMSO彡1%。)。
[0025] RPMI Medium 1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐(MTT)。
[0026] c)仪器
[0027] CO2培养箱(SANYO,日本)
[0028] 垂直层流洁净工作台(上海上净净化设备有限公司)
[0029] 倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)
[0030] 低/高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)
[0031] 电子天平(奥豪斯仪器有限公司)
[0032] 酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司)
[0033] 立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)
[0034] 鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)
[0035] PH 计(SART0RIUS,德国)
[0036] 2)实验方法和过程
[0037] 人乳腺癌细胞株MCF7以4000/孔的密度铺于96孔板,每孔IOOul,12h后使用。 各组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液,保存于-20°C待用。铺板后12h,观察细胞汇合率 约为40%,加药,浓度均为100 μ g/mL,每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组(培 养基+细胞;含〇. 1 % DMSO培养基+细胞),3个空白孔(只有培养基)。加入药物24小 时后,加入20 μ 1四甲基偶氮唑盐化学名为3-(4, 5-二甲基噻唑)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide,ΜΤΤ),继续培养 4 小时。完全弃去上清液,加入100 μ I DMS0,混匀使MTT完全溶解,去气泡。490nm测定OD 值。
[0042]
[0044] 结果发现:
[0045] 本发明优选如下方案:哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取,提取液浓缩后,用硅 胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗 脱,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱,石油醚:丙酮100:30 洗脱液经回收有机溶剂,干燥,得到高活性提取物,即为该抗肿瘤的提取物。该活性提取物 从未见文献报道,其TLC分析表征如图1。
[0046] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究
[0047] 1)提取溶剂的种类研究
[0048] 分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机溶 剂提取,并测试提取物的对MCF7细胞的抗肿瘤活性,结果如下:
[0049] 表 3
[0051] 研究结果表明:提取用溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、甲醇水混合溶剂、 乙醇水混合溶剂。
[0052] 2)提取溶剂的用量研究
[0053] 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取,并测试提取物 的抗肿瘤活性,结果如下:
[0054] 表4金莲花不同溶剂、溶剂用量提取物的收率及其对MCF7细胞的抑制活性
[0055]
[0058] 提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0059] 3)干燥方法的研究
[0060] 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法,对得到 的抗肿瘤活性提取物进行干燥,以含水量、TLC、活性测试为指标,发现真空干燥法、冷冻干 燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对MCF7细胞抗肿瘤活性提取物进行干燥,其 中,最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0061] 表 5
[0063] 因此,金莲花抗肿瘤提取物的制备方法为:
[0064] 哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅 胶柱,先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗脱2-50倍柱体积,继用 石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱2-50倍柱体积,石油醚:丙酮 100:30洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为该提取物。以上条件最优为先用石油醚:丙酮混 合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石 油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱15倍柱体积。其中,
[0065] 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、甲醇水混合溶剂、 乙醇水混合溶剂,最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的 2-50倍(重量/体积比)。
[0066] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等,最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0067] 5.金莲花抗肿瘤有效提取物的抗肿瘤活性研究
[0068] 利用各种肿瘤细胞,如乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝 癌等恶性肿瘤细胞株,分别测试金莲花抗肿瘤提取物的抗肿瘤活性,IC 5。结果如下:
[0069] 表 6
[0072] 因此,我们发现,金莲花抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性,可望用于各种肿瘤如乳腺 癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤细胞株的预防及治疗。
[0073] 6、金莲花抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研究
[0074] 1)固体分散体
[0075] 处方
[0077] 制备方法:
[0078] 称取金莲花提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比 分别放入烧杯中,加入无水乙醇,磁力搅拌器搅拌至金莲花提取物和载体完全溶解,转入旋 蒸仪中除去有机溶剂,干燥,粉碎过80目筛,即得金莲花提取物PVP包合物。
[0079] 2)环糊精包合物
[0080]处方:
[0082] 制备方法:
[0083] 将β -环糊精与1-5倍水研匀,加金莲花提取物(水难溶性的应先溶于少量有机 溶剂中)充分研磨至成糊状物,低温干燥即得。
[0084] 3)分散片处方:
[0086] 制备方法:
[0087] 1.金莲花提取物淀粉分散体的制备,精密称取金莲花提取物提取物,加入适量的 十二烷基硫酸钠,用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后,在70°C的温度 下蒸干,粉碎,过100目筛;
[0088] 2.称取处方量,金莲花提取物淀粉分散体,交联聚维酮,预胶化淀粉,用70 %乙 醇做湿润剂,边加入边搅拌,制成湿颗粒过14目筛,室温下放置15min后,60°C烘箱烘干 45min,16目筛整粒,加入滑石粉和微分硅胶,混合均匀后,压片。
[0089] 7、金莲花抗肿瘤有效提取物的检测方法研究
[0090] 我们发现,可以用薄层色谱的方法,很好地检测和标示金莲花抗肿瘤有效提取物 的特征。见图1
[0091] 色谱条件:GF254硅胶板,展开系统:石油醚:乙酸乙酯:丙酮=3:1:1,显色方法: 香草醛浓硫酸显色
【附图说明】:
[0092] 图1金莲花MCF7抑制活性提取物的TLC色谱图;
[0093] 图2金莲花得到的化学组分的TLC色谱图;
[0094] 图3金莲花得到的化学组分的TLC色谱图。
【具体实施方式】
[0095] 以下实施例表示本发明的实用性,本发明不受此限制。
[0096] 实施例1 :
[0097] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL甲醇超声提取15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分 离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6, 体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗 脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有机溶剂,真空干燥,即为该提取物,收 率 0· 74%。
[0098] 实施例2 :
[0099] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL乙醇超声提取15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分 离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6, 体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗 脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该提取物,收 率 0· 71%〇
[0100] 实施例3 :
[0101] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL丙酮超声提取15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分 离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6, 体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗 脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有机溶剂,鼓风干燥,即为该提取物,收 率 0· 63%。
[0102] 实施例4 :
[0103] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL氯仿超声提取15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分 离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6, 体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗 脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有机溶剂,离心干燥,即为该提取物,收 率 0· 66%。
[0104] 实施例5 :
[0105] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL乙酸乙酯超声提取15min,提取液浓缩后,用硅胶 柱分离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮, 100:6,体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:30,体积 比)洗脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有机溶剂,旋蒸干燥,即为该提 取物,收率0.68%。
[0106] 实施例6 :
[0107] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL甲醇水混合溶剂(甲醇:水=1:1)超声提取 15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙 酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂 (石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有 机溶剂,冷冻干燥,即为该提取物,收率〇. 71 %。
[0108] 实施例7 :
[0109] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL乙醇水混合溶剂(乙醇:水=1:1)超声提取 15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙 酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂 (石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有 机溶剂,真空干燥,即为该提取物,收率〇. 70%。
[0110] 实施例8:
[0111] 取哈萨克药金莲花20g,经100mL乙醇水混合溶剂(乙醇:水=90:10)超声提取 15min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(I. 8cm内径小柱),先用石油醚:丙 酮混合溶剂(石油醚:丙酮,100:6,体积比)洗脱10倍柱体积,继用石油醚:丙酮混合溶剂 (石油醚:丙酮,100:30,体积比)洗脱15倍柱体积,石油醚:丙酮,100:30洗脱液经回收有 机溶剂,冷冻干燥,即为该提取物,收率〇. 68%。
[0112] 实施例9 :固体分散体
[0113] 称取金莲花提取物和载体PVP按比例、1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中,加 入无水乙醇,磁力搅拌器搅拌至金莲花提取物和载体完全溶解,转入旋蒸仪中出去有机溶 剂,干燥,粉碎过80目筛,即得金莲花提取物PVP包合物。
[0114] 实施例10 :环糊精包合物
[0115] 将β -环糊精与1-5倍水研匀,加金莲花提取物(水难溶性的应先溶于少量有机 溶剂中)充分研磨至成糊状物,低温干燥即得。
[0116] 实施例11 :分散片
[0117] 1.称取干燥的金莲花提取物,加入适量的十二烷基硫酸钠,使用70%的乙醇充分 溶解,加入水溶性淀粉与金莲花提取物(I: 1),搅拌混合均匀,在70°c下干燥,粉碎,过100 目筛,得金莲花提取物分散体。
[0118] 2.精密称取处方量,金莲花提取物分散体,交联聚维酮,可压性淀粉,用70 %乙醇 做湿润剂,边加入边搅拌,14目筛制成湿颗粒,室温下放置15min后,70°C烘箱烘干45min, 16目筛整粒,加入滑石粉和微分硅胶,混合均匀后,压片。
【主权项】
1. 一种哈萨克药金莲花提取物,其特征为,哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取,提 取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用体积比100 :1-100:6石油醚:丙酮混 合溶剂洗脱,继用体积比100 :8-100:30的石油醚:丙酮混合溶剂洗脱,石油醚:丙酮100 : 8-100:30洗脱液即得。2. 如权利要求1所述的哈萨克药金莲花提取物,其特征为,先用体积比100:6的石油 醚-丙酮混合溶剂洗脱,继用体积比100:30的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱,石油醚-丙酮 100:30洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为该提取物。3. 如权利要求1或2所述的金莲花提取物,其特征为,提取用有机溶剂为甲醇、乙醇、丙 酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂,优选甲醇或95%乙醇,提取物提取 用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。4. 如权利要求1-3任何一项所述哈萨克药金莲花提取物,其特征为,石油醚-丙酮混合 溶剂洗脱体积为2-50倍柱体积。5. 如权利要求2所述的哈萨克药金莲花提取物,其特征为,先用体积比100:6的石油 醚-丙酮混合溶剂洗脱10倍柱体积,继用体积比100:30的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱15 倍柱体积。6. -种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-5任何一项所述的金莲花提取物和 药学上可接受的载体。7. -种药物制剂,其特征在于,包含权利要求1-5任何一项所述的金莲花提取物或权 利要求6所述的药物组合物。8. 权利要求1-5任何一项所述的金莲花提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求 7所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 如权利要求8所述的应用,其特征为,所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰 腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤或肝癌。10. 如权利要求1-5任何一项所述的哈萨克药金莲花提取物,其特征为,用TLC法检测, 其色谱条件为:GF254硅胶板,展开系统:石油醚:乙酸乙酯:丙酮=3:1:1显色方法:香草醛 浓硫酸显色。
【文档编号】A61K36/71GK105982973SQ201510079845
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】王金辉, 黄健
【申请人】沈阳药科大学
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