专利名称：防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法
技术领域：
本发明属于生化工程技术中植物培养的方法，特别涉及一种防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法。
在植物组织培养中，比如，在香石竹、花椰菜及矮牵牛等几十种植物培养中都发现了玻璃化现象。玻璃化现象特征是培养物矮小肿胀、呈半透明玻璃状；叶片为浅绿色或黄绿色，叶片厚而狭长，有时基部较宽，脆弱易碎，叶表面缺少角质层和蜡质或蜡质发育不完全；茎短粗扁平，节间很短；通过解剖进一步发现发生玻璃化的培养物，由于其叶片无功能性气孔，从而导致保卫细胞的功能失调不能关闭气孔，同时其叶片中仅有海绵组织，无栅栏组织；在茎内虽可见疏导组织，但其导管和管胞木质化不完全(王关林、方宏筠主编，植物基因工程原理与技术，科学出版社，1998)。所以玻璃化发生会造成植物组织畸形和变异，进而影响到植物在培养过程对营养物地吸收和光合作用的效率。
玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形且木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或关闭气孔等，从而导致细胞内多余水份不能及时排出，发生玻璃化现象；
已有研究证明发生玻璃化的植物苗体内水份含量高，干物质、叶绿素、木质素含量低，角质层、栅栏组织发育不全，吸收与光合功能不全。采用增加光强、提高培养基中琼脂浓度，降低细胞分裂素的用量，对减轻植物培养过程发生玻璃化有明显效果(肖玉兰等。克服香石竹试管苗玻璃化现象的研究。云南农业大学学报。1997，12(3)188-193)。比如，在香石竹组织培养中，随培养基中6-BA激素浓度的增加、培养基含水量的增加，植物玻璃苗含水量高于正常苗，因此玻璃化发生与植物体内含水量过高有关。植物排除体内多余水份方式之一就是靠蒸腾作用。在玻璃化的植物苗中只有一个保卫细胞，而且呈畸形，形状狭窄，气孔关闭，所以蒸腾作用减少，引起体内水份积累，细胞体积膨胀，液泡程度加剧，细胞质变薄，这一系列变化造成对细胞的挤压，促使气孔进一步关闭(李瑶等。影响香石竹试管苗玻璃化的因素。植物生理学通讯。1997，33(4)256-258)。
苹果组织培养时出现玻璃化现象是由于过氧化物酶-吲哚乙酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响，细胞激动素或NH3+离子过剩是一种最初的胁迫，由于在乙烯过剩的空气中生长抑制了体内乙烯的生物合成，降低了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酸性过氧化物酶的活性，从而阻碍组织的木质化，发生玻璃化现象(程家胜等。苹果组织培养中的玻璃苗问题。植物生理学通讯。1990，26(1)33-35)。
利用中子活化分析研究珠美海棠(Malus zumi)的玻璃化发生过程发现在玻璃化发生过程中，玻璃苗每个部位纤维素及木质素含量均低于正常苗，其中叶片减少最突出，其次是茎尖段，同时在整株中不同部位纤维素、木质素含量分布亦发生了改变，造成生长旺盛部位纤维素、木质素含量太低，满足不了正常代谢的需要，玻璃化现象并首先表现在茎尖段(李云等。玻璃苗中纤维素、木质素及元素含量的研究。核农学报。1997，11(1)103-111)；
玻璃化现象发生后，培养物在结构、形态及生化特性上都发生了很多变化，如叶肉中的叶绿素含量、蛋白质含量、一些酶的活性及乙烯合成能力均相继发生变化。对玻璃化组织与其培养环境的关系研究表明低温处理及Cl-、NO3-、Ca2+等离子对洋蓟玻璃化无影响，玻璃化的形成与植物组织生长环境中的水分、营养条件、激素水平等有关；一旦形成玻璃化有时改善某一条件可能对玻璃化程度有所缓解，但难以彻底解决。
目前预防玻璃化发生一般采用降低培养基激素水平，防止不正常的脱分化；减少培养基中水份含量；避免高温和纯化培养物等方法，但这些方法在不定芽培养及种苗繁殖中往往不适用于减轻和防止玻璃化现象的发生，例如在青蒿丛生芽的液体悬浮培养中，发生培养物玻璃化现象是普遍存在的问题，青蒿芽生长的适宜温度在25-28℃，青蒿素合成的适宜温度在30℃左右，而且激素NAA和6-BA是分化所需要的，无法采用降低培养温度、取消或减少激素用量等传统办法来减少或防止玻璃化现象的发生，因而需要探索新的防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法。
在植物芽苗的培养中，以青蒿丛生芽的培养为例青蒿丛生芽的培养在1-20天均呈现快速生长，并且没有明显的延迟期。细胞膜渗透性在0-10天呈快速下降趋势，在随后的11-25天逐渐上升，在26-30天又逐渐下降，30天以后又快速上升。在芽生长和青蒿素合成的1-35天内细胞膜渗透性始终低于初始(0天)细胞膜渗透性，这可能是造成青蒿芽产生玻璃化的重要原因之一。因此可知，通过调节植物芽苗生长过程中细胞膜渗透性，使细胞内外水份及时达到平衡，可减轻或消除玻璃化现象发生。
玻璃化产生的一个重要因素是培养基中存在植物激素，如NAA和6-BA等，特别是6-BA，但是这些激素对植物芽的分化、生长均具有至关重要的作用，如果能降低或取消培养基中的植物激素，势必会影响芽苗的生长，若能寻找到有机植物激素的替代物，而减少激素用量，将是解决植物芽玻璃化问题的有效途径之一。
本发明的目的在于提供一种简单、易行，而且可减少甚至完全替代培养基中植物激素的一种防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法
技术领域：
本发明的技术方案如下
本发明提供的防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，步骤如下
1.配制培养基
A.配制液体培养基
在MS液体培养基中添加20-30g/L的蔗糖，0-2.0mg/L 6-BA，0-0.2mg/L NAA，再加入含单一或混合稀土元素化合物溶液或海带硫酸酯多糖溶液，并进行高压灭菌处理，或者采用除菌过滤器将含单一或混合稀土元素化合物溶液或海带硫酸酯多糖溶液直接加入灭菌后的培养液中；所加入的单一或混合稀土元素在培养基中的浓度0.0001-0.5mmol/L；所述海带硫酸酯多糖在培养基中浓度为0-1％；
B.配制固体培养基在上述液体培养基中加入6-10g/L琼酯，并进行高压灭菌处理；
2.将植物器官种苗接入上述液体或固体培养基中，在温度为25-30℃，光照为2000-5000lux的条件下，培养20-30天。
所述的单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物；所述海带硫酸酯多糖为海带多糖、岩藻糖；所述植物器官为植物芽或植物毛状根。
用本发明提供的含稀土元素的培养基对植物芽苗进行培养的实验证明，培养基所含适宜的浓度的稀土元素可促进植物芽苗生长，以青蒿芽苗的培养为例，还可促进青蒿素的合成，这是由于稀土元素不但可以改变培养物细胞膜渗透性，而且具有激素样作用，可以部份取代NAA或完全取代6-BA，从而防止青蒿芽苗培养过程中发生玻璃化现象。
青蒿芽生长过程中含水量的变化在细胞膜渗透性快速增长的0-5天芽的含水量增加很少，在第5天以后含水量就快速上升，实验中亦同时观察到芽的玻璃化程度在第5天以后变得越来越严重。因而芽的含水量可以作为玻璃化程度的一个重要的度量指标。
通过研究发现植物激素在植物芽、苗生长过程中具有重要的作用，但同时它们其中的某些成分是玻璃化产生的重要因素，本发明用稀土元素部份或完全取代培养基中的植物激素，可大大减轻甚至有效防止玻璃化。如在青蒿丛生芽和苗的培养中，用含镧、铈、钕及混合稀土元素Re同时取代培养基中的植物激素NAA和6-BA时，对芽的含水量影响较小；仅取代NAA时，对芽的含水量几乎无影响；仅取代6-BA时，对芽含水量的影响很明显。青蒿芽培养基中6-BA是造成芽含水量过高，产生玻璃化的重要因素。稀土元素可以取代6-BA，降低青蒿芽的含水量，从而大幅度减轻芽的玻璃化程度。
海带多糖是从海带中分离提取出来的一种混合多糖，它含SO42-约30％，岩藻糖约30％，半乳糖10-15％，总糖含量大于50％，平均分子量约2万，含水量小于10％。不同浓度海带多糖对芽的含水量有所影响，在较低浓度下，芽的含水量有所降低，经过25天培养后，悬浮培养的芽其形态基本能恢复到固体培养的水平。研究芽含水量动力学结果表明加入海带多糖在培养20天以后，含水量急剧下降，而对照样品却是急剧上升。这说明海带多糖对青蒿芽培养过程中玻璃化现象具有良好的抑制作用，为解决植物芽玻璃化问题提供了一条崭新的方法。
下面结合附图及实施例进一步描述本发明
实施例1
配制培养基1、2、3及对照，培养基1、2、3及对照中蔗糖含量均为2％，加入6-BA，NAA及再加入三氧化二镧的硝酸溶液后镧在培养基中的浓度如表1所示，将培养基经高压蒸汽灭菌处理后，接入青蒿芽进行培养，其培养条件为温度28℃，光照3000lux，悬浮培养25天，悬浮培养后青蒿芽含水量结果见表1。
表1
实施例2
配制培养基1、2、3及对照，培养基1、2、3及对照中蔗糖含量均为2％，加入的6-BA，NAA及再加入铈氧化物的硝酸溶液后，铈在培养基中的浓度见表2，将培养基经高压蒸汽灭菌处理后，接入青蒿芽进行培养，培养条件同实施例1，其悬浮培养后的青蒿芽含水量结果见表2。
表2
实施例3
配制培养基1、2、3及对照，培养基1、2、3及对照中蔗糖含量均为2％，加入6-BA，NAA及再加入混合稀土Re的硝酸溶液后，混合稀土Re在培养基中的浓度见表3，将培养基经高压蒸汽灭菌处理后，接入青蒿芽进行培养，培养后青蒿芽含水量结果见表3，其培养条件同实施例1，经过25天培养发现显著减轻青蒿芽的玻璃化程度，青蒿芽含水量结果见表3。
表3
注混合稀土Re(71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.44％Pr6O11+0.3％Sm2O3，w/w)。
实施例4在加入了2％蔗糖，0.8％琼脂，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA的MS固体培养基中分别加入含镧、铈、钕或混合稀土Re的化合物溶液，配制四种培养基，培养基1中镧的含量为0.2mmol/L；培养基2中铈的含量为0.05mmol/L；培养基3中钕(加入的是三氯化二钕水溶液)的含量为0.1mmol/L；培养基4中混合稀土Re(71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.44％Pr6O11+0.3％Sm2O3，w/w)的含量为0.5mmol/L；将青蒿芽分别接入上述四种培养基中进行培养，其培养温度为28℃，光照为3000lux，培养25天，发现显著减轻青蒿芽的玻璃化程度，青蒿芽培养物的含水量分别降低了2.8％、2.3％、2.6％和2.7％。
实施例5培养条件同实施例1，在培养基中加入不同浓度的海藻硫酸酯多糖后减轻了青蒿芽的玻璃化程度，结果如
图1所示。
图1中横坐标为培养基中多糖的百分含量，纵坐标为青蒿芽含水量
为青蒿芽含水量随培养基中多糖含量而变化的变化曲线。由
图1可以看出经过25天培养后，悬浮培养的青蒿芽培养物的形态基本恢复到固体培养的水平。
实施例6培养条件同实施例1，在加了2％蔗糖、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA的MS培养基中再通过除菌过滤器加入0.2％海带多糖后；将青蒿芽接入培养基进行培养，结果如图2所示。图2中横坐标为培养时间(天数)，纵坐标为青蒿芽含水量
为青蒿芽含水量随培养时间而变化的变化曲线
为对照组含水量随培养时间而变化的变化曲线。从图2可知在0-10天没有降低青蒿芽的含水量，在10-20天青蒿芽的含水量开始略低于对照组(对照组是指在MS培养基中培养的结果)，在20天以后加入海带多糖的青蒿芽培养物含水量快速下降，而对照组青蒿芽培养物的含水量却快速上升，即加入海带多糖后青蒿芽培养物的玻璃化程度受到有效抑制，芽生长良好，形态正常，而对照组样品的玻璃化程度越来越严重，表现出茎叶水肿，呈半透明状。
实施例7培养条件同实施例1，在加了2％蔗糖、1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS培养基中再通过除菌过滤器加入0.1％海带多糖后，再分别加入0.1mmol/L镧(培养基1)、0.02mmol/L铈(培养基2)、0.06mmol/L钕(培养基3)、0.1mmol/L混合稀土(培养基4)，将青蒿芽分别接入培养基中进行培养，经过25天培养，发现显著减轻青蒿芽的玻璃化程度，芽的含水量分别降低了3.3％、2.8％、2.9％和3.1％。
权利要求
1.一种防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，步骤如下
(1)配制培养基
A.配制液体培养基
在MS液体培养基中添加20-30g/L的蔗糖，0-2.0mg/L 6-BA，0-0.2mg/L NAA，再加入含单一或混合稀土元素化合物溶液或海带硫酸酯多糖溶液，并进行高压灭菌处理，或者采用除菌过滤器将含单一或混合稀土元素化合物溶液或海带硫酸酯多糖溶液直接加入灭菌后的培养液中；所加入的单一或混合稀土元素在培养基中的浓度0.0001-0.5mmol/L；所述海带硫酸酯多糖在培养基中浓度为0-1％；
B.配制固体培养基在上述液体培养基中加入6-10g/L琼酯，并进行高压灭菌处理；
(2)将植物器官种苗接入上述液体或固体培养基中，在温度为25-30℃，光照为2000-5000lux的条件下，培养20-30天。
2.按权利要求1所述的防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，其特征在于所述的单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物；
3.按权利要求1所述的防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，其特征在于所述植物器官种苗为植物芽或植物毛状根。
4.按权利要求1防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，其特征在于，所述海带硫酸酯多糖为海带多糖、岩藻糖。
全文摘要
本发明涉及的防止植物不定芽及种苗培养玻璃化的方法，在对传统的MS培养基进行改进后，再加入单一/混合稀土元素化合物或和海带硫酸酯多糖，所述单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物，减少或替代培养基中NAA、6－BA激素，在这种培养基对植物器官进行培养，可有效地减轻和防止植物不定芽和种苗玻璃化现象的发生。
文档编号A01H4/00GK1391796SQ0111597
公开日2003年1月22日 申请日期2001年6月15日 优先权日2001年6月15日
发明者赵兵, 王玉春, 欧阳藩, 王晓东 申请人:中国科学院化工冶金研究所