球状体的制备的制作方法

专利名称：球状体的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工制备的立体结构形式的细胞聚集体，即已知的球状体、再聚集体、类器官和低温体(cryoid)形式的细胞聚集体。
球状体具有用作不同组织类型的体外模型的巨大潜力，尤其是用作测试新化学物质(NCE′s)和/或新治疗剂的模型的潜力。
WO-A-98/35021描述形成球状体然后将其低温储藏的方法。在形成球状体的一种方法中，先以第一速度进行一段时间的定轨旋转，接着再以第二速度进行一段时间的定轨旋转，该第二速度大于该第速度。
制备球状体的现有方法往往会获得成群的大小不均匀的球状体。从以下至少三方面来看，这是不利的特征。首先，不同大小的球状体，其存活时间往往会不同。因此，给定批次中制得的一群球状体将包括存活时间相对短和相对长的球状体。这对于用于评估药物候选物和/或NCE′s的组织模型而言，是不利的。其次，不同大小的球状体可能会对药物候选物和/或NCE作出不同的反应，例如对于渗透到球状体中的程度方面对药物候选物和/或NCE作出不同反应。这将使结果分析变得困难。最后，不同大小的球状体，在暴露于药物后将显示出不同的功能性反应，这将会混淆数据分析，包括药效和/或毒性的评估。
需要能提供一种制备球状体的方法，该方法产生的球状体群在大小上均匀(见


图1)。
根据本发明的第一个方面，本发明提供一种形成球状体的方法，该方法包括(a)从组织或器官或其部分获得和/或衍生出多个细胞；(b)在液体培养基中以第一速度定轨旋转所得细胞一段足以形成球状体的时间；(c)在液体培养基中，以低于所述第一速度的第二速度进一步定轨旋转步骤(b)中获得的球状体。
本发明制得的球状体可用作体外模型，因此对于使用活动物来说，是优选的替代物。优选的模型是哺乳动物(如人，非人灵长类动物，猪、啮齿动物)或鸟类(如鸡)模型。
在本文中，球状体指一种三维结构，通常为球形、自然中不出现，且由细胞再聚集体组成，这种再聚集体通常含有103个或更多细胞，而细胞通常得自组织或器官；或者球状体是由单独的或组合的细胞系形成。
本发明方法的一个优点是，采用该方法能产生均匀的球状体群。因此，可实施本发明方法，这样使所形成的大部分球状体(例如至少75％，更佳至少90％)的大小在一个较窄的大小范围之内，并且，从形态学上看，单个球状体的形状是规则的，且具有光滑的表面。
适当窄的大小范围，以球状体的直径计，为100-350μm。此范围的上限是在实际使用中产生的实用上限，因为直径较大时，根据组织类型，由于养分进入球状体中、废物排泄到球状体外的扩散速率不足，球状体的中心出现坏死。因此，本发明方法通常可用于制备至少75％、较佳至少90％的球状体直径在100-350μm范围内的球状体群。
更佳的狭窄的大小范围是150-200μm的直径，这个范围是从大多数组织类型制得的球状体的适当范围。较佳采用本发明方法制备至少75％、较佳至少90％的球状体的直径在此范围内的球状体群。
本发明的球状体由一种或多种不同的细胞类型构成。如果存在许多不同的细胞类型，则它们可形成球状体的不同的层。
术语“组织”在本文中指具有共同功能的细胞的组织化选择。术语“器官”指具有共同功能的“组织”的组织集合。术语“细胞系”指从进行转化的细胞衍生得到的连续的细胞培养物，或者是已获得连续地分裂能力的连续的细胞培养物。
本发明使用的“组织”或“器官”不需要是完全无损的，因为可在再聚集以形成本发明的球状体之前，先将整个组织或器官的一部分(可能是活检获得)切成单独的细胞/小的细胞组。
可从任何合适的组织来源获得用于形成本发明球状体的细胞，包括感染的组织。对于含有神经元细胞的球状体(如脑球状体)，优选是胎儿组织。对于含有其它细胞的球状体，通常可使用从胚胎/胎儿和非胎儿(如成人来源)获得的组织。肝细胞特别有用，因为可用它们产生保留肝的一些特征(如白蛋白分泌、尿素分泌、葡萄糖分泌)的球状体，因此可将它们用于体外模拟肝中物质的代谢，并用于研究常规细胞毒性和特殊的肝毒素效果。这在如测定具体的物质被肝代谢后是否可能有毒和/或是否直接对肝细胞有毒(即肝毒素)或者是否干扰一般的细胞功能方面是有用的。
原则上，可从任何动物的任何需要的组织或器官中，通过将该组织或器官破裂(disrupt)，较佳是破裂成单独的细胞或小的细胞群，从而可产生球状体。例如，对于视网膜和脑组织，可采用机械破裂，如使用Pasteur移液管进行温和地捣碎。或者，可采用酶消化方法，例如对于肝细胞的离解。
也可使用从细胞系获得的细胞。开始时可将这些细胞培养成单层，以产生更多的细胞。可采用胰蛋白酶作用进行单层细胞培养物的离解。
较佳的是，用于制备本发明球状体的细胞样品是具有高细胞存活力(较佳大于或等于75％存活力)的样品。
在本发明方法中，首先以第一速度使细胞悬浮液定轨旋转，接着以低于该第一速度的第二速度定轨旋转一段时间。旋转速度的实际值将根据不同的细胞类型而改变，但通常第一旋转速度大于77rpm，第二旋转速度将小于80rpm。因此，例如第一旋转速度可以是77-90rpm，较佳是83-87rpm，而第二旋转速度可以是77-90rpm，较佳是83-87rpm。
两次定轨旋转的旋转持续时间可以为在第一速度时1-4天，较佳为1-2天，然后在剩余的培养时间内(如2-45天，或者较佳为2-35天)维持第二速度或接着的较低的速度。用于定轨旋转的细胞悬浮液的初始细胞接种密度根据不同的细胞类型而改变，但通常可在每毫升3×105-5×106个细胞的范围内。
在本发明的一个实施例中，对含有细胞的小体积培养基进行定轨旋转，例如，每个孔2.5-4.5毫升。这个体积通常含有足够的养分，足以维持正确密度的细胞达2天(根据细胞类型及其代谢需求)，并且这样的体积使摇动更有效。可使用含有多个孔(例如6个孔)的平板。
定轨旋转过程中用于悬浮细胞的液体培养基可含有以下任何一种或多种成分氯化钠、葡萄糖、血清、抗生素、已知成分培养基添加物。所使用的培养基将根据细胞类型而改变。但是，可使用任何合适的标准培养基。典型的培养基将包括平衡盐溶液和葡萄糖，且需要监测并控制其pH。
可如WO98/35021所述低温保藏本发明制得的球状体。
因此，在低温保藏步骤中，可用低温保藏剂保藏球状体。
可使用各种低温保藏剂，但优选DMSO。
其它低温保藏剂包括除了DMSO之外的渗透性低温保藏剂，如甘油、1，2-丙二醇、乙酰胺、乙二醇(ethylclyol)和丙二醇〔Karlsson J O M，和Tomer M.，“采用低温保藏的组织的长时间储存关键的问题”(Long-term storage of tissuesby cryopreservationcritical issues)，《生物材料》(Biomaterials)，1996，17243-256；Chao N H，Chiang C P，Hsu H W，Tsai C T和Lin T T(1994)，“牡蛎胚胎对选择的低温保护剂的毒性耐受”(Toxicity tolerance of oyster embryos toselected cryoprotectants)，《水生生物资源》(Aquatic Living resourse)，7(2)99-104〕。也可使用非渗透性低温保藏剂，如甲基纤维素聚乙烯基吡咯烷酮、羟乙基淀粉和各种基于糖的低温保藏剂。
需要的是，在进行低温保藏之前，低温保藏剂至少占其与球状体的组合物的5％v/v(如10-20％v/v)。
可以认为，如果以逐步的方式冷冻球状体，则可获得最佳的结果。因此，在本发明的优选方法中，将球状体冷却，然后在进一步冷却前维持在给定的温度范围内。不想被任何理论束缚，也有可能的是，这个过程使构成球状体的细胞有足够的时间适应冷的温度，从而避免可能发生的细胞死亡或损伤。
可将球状体冷却至1-8℃(如2-6℃，较佳约为4℃)，并在进一步冷却前维持一段时间。这段时间可以至少为10分钟，较佳至少为30分钟，通常为40-60分钟。可使用实验室用的冰箱即可方便地实现这种冷却。
然后可将球状体冷冻到0℃到-50℃(如-10℃到-30℃，较佳为-15℃到-25℃)，然后在进一步冷冻之前维持一段时间。可使用实验室用的冷冻机方便地实现此冷冻。这段时间可以至少为30分钟，较佳至少为1小时(如1-6小时)。
冷冻过程的最后步骤通常是快速地冷冻到-100℃(如-190℃)以下。可使用液氮作为冷冻剂实现。即，将含有球状体和低温保藏剂的弹性容器放到液氮中。
在低温保藏后，将球状体解冻。可通过将含有球状体的溶解放到37℃的水浴中，通常维持至少2-3分钟，即可将其解冻。一旦解冻，可通过离心除去低温保藏培养基。然后洗涤球状体，并进一步除去痕量低温保藏培养基(如通过离心)。
在解冻球状体后还需要对球状体进行定轨旋转。可以一种或多种至少为50rpm(如50-77rpm)的旋转速度进行。如果采用两种或多种不同的定轨旋转速度，则以第一速度旋转一段时间后通常以高于该第一速度的第二速度旋转一段时间。
较佳的是，以50-70rpm(如约60rpm)的旋转速度旋转球状体(低温保藏后)。通常，可旋转至少6小时(如12-48小时)。接着可以较高的速度(如至少70rpm)、较佳约为75rpm)旋转一段时间。这个旋转的时间通常至少为7-10天或更长。
通常，在低温保藏后，可使解冻的球状体维持在培养基中几天。
下面将结合下述附图，以举例的方式描述
具体实施例方式
图1显示本发明制得的均匀的球状体群。
图2是显示暴露24小时后的D-半乳糖胺的各个浓度对大鼠肝球状体中的蛋白质含量的影响的图。
图3是显示暴露24小时后的D-半乳糖胺的各个浓度对肝细胞的LDH泄漏的影响的图。
图4是显示D-半乳糖胺的各个浓度对大鼠肝球状体中进行的尿素合成的影响的图。
图5是显示D-半乳糖胺的各个浓度对大鼠肝球状体中进行的白蛋白合成的影响的图。
图6是显示D-半乳糖胺的各个浓度大鼠肝球状体中的谷胱甘肽浓度的影响的图。
对于图2-6中所示的数据，这些结果是平均值±SEM，n＝6，p＜0.05。
实施例在此实施例中，根据本发明制得成年大鼠肝球状体。
肝细胞球状体培养物采用Seglen P.O.〔1976，“分离的大鼠肝细胞的制备”，Methods Cell.Biol.，13，29-38〕所述的两步胶原酶灌注法和Lazar，A.、Peshwa，M.V.、Wu，F.J.、Chi，C.M.、Cerra，F.B.和Hu，W.S.(1995)所述的改动形式〔“俘获在胶原凝胶中的猪肝细胞球状体的扩展肝特异性功能”(Extended liver-specific functions ofprocine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel)，In Vitro Cell Biol Anim.，31，340-346〕，从雄性大鼠的肝制得肝球状体。采用台盼蓝染色排除法(trypanblue dye exclusion)，即将分离的肝细胞的等分试样与等体积的台盼蓝染料(1.0％w/v，等渗盐水)混合，在室温培养最少5分钟的时间，从而测定这些分离的肝细胞的存活力。仅使用存活力在80％以上的分离的肝细胞制品制备肝球状体。用培养基(用10％FCS、200mM的L-谷氨酰胺、2ng/ml胰岛素，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素补充的肝细胞培养基)稀释细胞悬浮液，得到5×105个细胞/ml的细胞密度。将稀释的细胞悬浮液分散到6孔平板中，3毫升/孔。在培养器中，在37℃、5％CO2的旋转(gyrotatory)振荡器(New Brunswick)上培养平板，初始的旋转速度为85rpm，旋转24小时，然后以77rpm旋转。在整个研究过程中，平板以这个速度旋转(达45天，但通常为2-10天)。每隔一天用2.0毫升的新鲜培养基替换各孔中的1.5毫升老培养基。在整个研究过程中(达45天，但一般为2-10天)，都进行培养基交换。
所制得的球状体如
图1所述，它们具有均匀的大小，通常为170μm，其中＞80％的球状体的直径在160-180μm范围之内。
然后，测试本实施例从成年大鼠肝球状体培养物制得的球状体，以研究它们作为用于研究模型肝毒素(model hepatoxin)的作用的体外模型的合适性，具体如下肝毒素D-半乳糖胺对体外大鼠肝球状体的作用D-半乳糖胺(GalN)体内通常以某种结构的多糖的乙酰化形式存在，是一种已知的可产生急性肝坏死的肝毒剂。因此，在肝损伤的研究中，已广泛使用它作为模型肝毒素。肝中的GalN被转化成尿苷二磷酸半乳糖胺，并引起快速和大量的尿苷三磷酸(UTP)损耗和ATP的减少，接着导致肝细胞中的次级生化变化，包括RNA和蛋白质合成的抑制。
化学药品和培养基从GibcoBril获得L-谷氨酰胺。从Imperial购得胎牛血清(FCS)。从Sigma获得肝细胞培养基、D-半乳糖胺(GalN)、青霉素和硫酸链霉素以及其它化学药品和试剂。
统计学采用ANOVA和两样品student t-测试分析所有生化试验的数据。在两个测试中，P＜0.05被认为具有显著性。
用于球状体功能性测试的中毒(intoxification)方法用3毫升的0、5、10、20或40mM GalN在无血清肝细胞培养基(补充了200nM的L-谷氨酰胺、2ng/ml胰岛素、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素)中的溶液完全替换6孔平板中的老的肝细胞球状体培养基，每块平板一种浓度。在培养箱中，在37℃、CO2/O25/95％和水饱和环境中，在旋转振荡器上以75rpm的速度培养平板24小时。
样品制备在暴露于GalN 24小时后，收集6孔平板各孔中的球状体，将其转移到ependorff管中。以900g离心这些管3分钟，保留上清液，用于尿素、白蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)试验。然后在1毫升均化缓冲液(含有NaH2PO42H2O，2mM；Na2HPO4，2mM；EDTA，0.5mM和NaCl，145mM)中均化球状体。涡旋各均化物的100μl的10％TCA溶液，将其用于谷胱甘肽试验。余下的均化物用于蛋白质试验。所有的样品在-20℃保存，直到用于试验。
生化试验1.蛋白质在含有2mM NaH2PO42H2O、2mM Na2HPO4、0.5mM EDTA和145mM NaCl的均化缓冲液中均化球状体。采用Bradford(1976)开发的方法评估总蛋白。以1∶2稀释均化物，将10μl加到96孔平板的各孔中。采用Micro Protein试剂盒(Sigma，商品目录号610-A)测定蛋白质含量。用蒸馏水以1∶5稀释少量蛋白质试剂。将250μl稀释的蛋白质试剂加到各孔中。将平板放置在室温下5分钟。在微平板读数器(Multiscan RC，Labsystem)上在595nm读取吸光度。
图2显示了肝球状体中的蛋白质含量。20mM或较低GalN组中的总蛋白含量并未受到影响。但是，40mM浓度的GalN与对照相比，明显减少了球状体的总蛋白含量(p＜0.05)。一些球状体在此最高浓度还受到破坏，这表明这个浓度的GalN引起急性细胞死亡。
2.白蛋白采用白蛋白试剂盒(Albumin Reagent Kit，BCG，Sigma)测试培养基中的白蛋白浓度。用蒸馏水以1∶6稀释原始的试剂。将方法修改成适用于96孔平板的模式。将20μl的等分培养基加到各孔中，然后加入200μl的稀释试剂。在微平板读数器(Multiscan RC，Labsystem)上在630nm读取吸光度。
图5显示暴露于GalN后的肝球状体的白蛋白合成。暴露于GalN后的白蛋白合成显示了浓度依赖性的下降。与对照相比，在GalN浓度为40mM浓度时有明显的下降(p＜0.05)。
3.尿素使用Urea Nitrogen试剂盒(商品目录640-A，Sigma)测定培养基中尿素的浓度。对该方法进行修改，以使其适用于96孔平板形式以及用微平板读数器的试验。用PBS以1∶2稀释样品。将25μl尿素酶加到各孔中，接着加入10μl稀释的培养基，从而测定各样品中的总铵氮。摇动平板，以进行混合，并使反应在室温进行20分钟。然后，依次将下述试剂加到各孔中50μl的苯酚硝普钠、50μl的碱性次氯酸溶液和200μl蒸馏水。摇动平板，以进行混合，并将平板保持在室温30分钟。产生蓝颜色，在微平板读数器(Multiscan RC，Labsystem)上在590nm读取吸光度。将25μl无尿素酶的PBS加入，接着加入10μl的培养基，测定游离的非尿素氮。其余的试验步骤和试剂与上述的总铵氮试验一样。用总铵氮减去游离的非尿素氮，得到各样品的尿素浓度。
在减去游离的非尿素氮后，肝球状体的尿素合成，在暴露于GalN 24小时后，显示出浓度依赖性的增加。在10mM或更高的GalN浓度条件下，球状体中尿素的合成速率明显高于对照的合成速率(所有的p＜0.05)。参见图4。
4.谷胱甘肽(GSH)采用荧光法〔Hissin P.J.，和Hilf(1976)，“用于测定组织中的氧化和还原谷胱甘肽的荧光法”(A fluorimetric method for the determination of oxidisedand reduced glutathione in tissues)，Anal.Biochem.，74，214-226〕，测定球状体中的谷胱甘肽水平。将从各样品获得的100μl的球状体均化物等分试样与等体积的10％三氯乙酸(TCA)混合，然后在3000g离心3分钟。将75μl的上清液或标准加到2775μl的磷酸盐/EDTA缓冲液(1升，含有13.6g KH2PO4，1.86gEDTA，pH8)中，接着加入150μl的0.1％邻苯二醛(o-phthaldehyde，OPT)在甲醇中的溶液。温和搅拌样品，并在室温保持30分钟。在荧光计上以350nm的激发波长和420nm的发射波长读取吸光度。
暴露于GalN后的谷胱甘肽含量显示在图6中。在GalN的浓度为20mM或更低时，谷胱甘肽含量并未下降，但是GalN的浓度为40mM时，谷胱甘肽含量明显下降(p＜0.05)。
5.乳酸脱氢酶(LDH)泄漏采用Korzeniewski和Callewaert〔Korzeniwski C.和Callewaert，D.M.(1983)，“天然细胞毒性的酶释放试验”(An enzyme-release assay for naturalcytotoxicity)，J Immun.Meth.，64，313-320〕的方法监测培养基中的LDH。将100μl的球状体均化物样品或培养基样品加到96孔平板中，同时加入100μl含有54mM L(+)乳酸盐、1.3mM β-NAD、0.28mM吩嗪甲硫酸酯(phenazinemehtosulphate)、0.66mM的对碘硝基四鎓紫(p-iodonitrotetrazolium violet)在0.2MTris缓冲液(pH为8.2)中的溶液的LDH试剂。在微平板读数器(Multiscan RC，Labsystem)上以10秒的时间间隔监测490nm所产生的吸光度15分钟。
暴露于GalN中24小时后的肝球状体的LDH泄漏显示在图3中。与对照相比，在暴露4小时后，在GalN浓度为20mM和40mM时的KDH泄漏的明显增加是可检测的(p＜0.05)。在24小时后，在GalN浓度为10mM时的LDH泄漏也明显增加(p＜0.05)。LDH泄漏显示为浓度依赖性的增加。
结论本研究已显示，20mM的GalN引起功能性改变，但是并未降低蛋白质和谷胱甘肽水平。而40mM的GalN除了诱导其它的毒性变化外，还明显降低了蛋白质和谷胱甘肽水平。显著的蛋白质损失反映了大百分比的细胞死亡。在最高浓度时谷胱甘肽的减少可能要归因于GalN的肝毒性作用，但是，并不清楚谷胱甘肽的减少是由GalN诱导的，还是是细胞死亡的结果。采用肝球状体测试，可得到在GalN诱导的肝毒性的抑制中不可能涉及谷胱甘肽的结论，因为20mM的GalN引起功能性的变化，但是并未影响到谷胱甘肽水平。因此，选择一个适当的浓度范围对于体外研究是关键的，尤其是用于中毒后生化评估，否则可能导致毒性的高估或低估。
权利要求
1.一种形成球状体的方法，其特征在于，该方法包括(a)从组织或器官或其部分获得和/或衍生出多个细胞；(b)在液体培养基中以第一速度定轨旋转所得细胞一段足以形成球状体的时间；和(c)在液体培养基中，以低于所述第一速度的第二速度进一步定轨旋转步骤(b)中形成的球状体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，以低于80rpm的第二速度旋转细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，以至少77rpm的第一速度旋转细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，以77-90rpm的第一速度旋转细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，以83-87rpm的第一速度旋转细胞。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，细胞旋转的持续时间为1-4天。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，细胞旋转的持续时间为1-2天。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，细胞旋转的持续时间为2-45天。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，细胞旋转的持续时间为2-35天。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(d)低温保藏步骤(c)所产生的球状体。
11.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的细胞得自哺乳动物或鸟类的组织或器官或细胞系。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物组织或器官或细胞系是人、非人、灵长类动物、猪或啮齿动物的组织或器官或细胞系。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述鸟类组织是鸡的组织。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，实施所述方法，在得到的球状体群中，至少75％的球状体的直径为100-350μm。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，至少75％的球状体的直径为150-200μm。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，至少90％的球状体的直径为100-350μm。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，至少90％的球状体的直径为150-200μm。
18.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，各球状体由至少103个细胞的再聚集体构成。
19.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述球状体的形状在形态学上是规则的。
20.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述球状体具有光滑的表面。
21.用前述任一项权利要求所述的方法制得的球状体。
22.一种体外模型，其特征在于，它含有采用权利要求1-20中任一项所述的方法制得的球状体。
全文摘要
本发明公开了一种形成球状体的方法，该方法包括(a)从组织或器官或其部分获得和/或衍生出多个细胞；(b)在液体培养基中以第一速度定轨旋转所得细胞一段足以形成球状体的时间；(c)在液体培养基中，以低于所述第一速度的第二速度进一步定轨旋转步骤(b)中获得的球状体。
文档编号A01N1/02GK1479786SQ01820128
公开日2004年3月3日 申请日期2001年12月7日 优先权日2000年12月7日
发明者W·珀塞尔, J·许, W 珀塞尔 申请人:西英格兰布里斯脱大学