专利名称：一种获得近交系小型猪的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得近交系动物的方法，特别是涉及一种获得近交系小型猪的方法。
背景技术：
近交系实验动物基因高度纯合，能象物理学研究中的精密仪器和化学反应中的分析纯试剂那样，为生物医学及整个生命科学研究提供灵敏的、偏差极小的实验结果。随着近交系小鼠、兔和近交系鸡的研究开发应用，开拓和解决了哺乳动物遗传、发育、生理等多方面的诸多新难题，对生物学、生命科学尤其是人类医学的发展起到了不可估量的作用。自C.C.Little(1909年)培育出近交系DBA小鼠以来，目前国际上已培育出近交系小鼠388个、近交系家兔34个、近交系鸡40个，以满足科学研究的需求。但由于大型试验动物在生理繁育特性、遗传规律等诸多方面与小型试验动物不同，近交繁育极为困难，虽已经历较长的研究历程、取得了某些进展(Wessea，1950、J.F.Lasley，1978、李登元等，1982)，但至今未见成功报导。
国内外大量的研究结果表明，猪与人的生理解剖、血管系统、消化系统、骨骼发育、营养代谢等有较大的相似性，比如人和猪血液pH、红细胞数量、红细胞直径非常接近，分别为0.737-0.745，0.736-0.749；4.0-5.5×1012/L，5.0-7.0×1012/L；7.1微米，6.1微米。从而保证了猪血液输入人体中时，可顺利通过人体各部位的毛细血管。由此，国内外专家在以下几个方面已达成共识猪是人理想的动物模型、异种器官移植供体。80年代开始，国内外将猪作为实验动物用量大增，已有代替犬的趋势。目前，国际上小型猪已广泛应用于药学、比较医学等领域，正向着SPF化的培育方向发展。世界各国为满足不同目的，已培育出20多种实验用小型猪，但均非近交品种。
五指山小型猪(Wu Zhishan miniature pig)原产于海南省中部交通不便、自然封闭及没有饲养公猪习惯的热带山区。在这种特定的生态环境下，通过历代多年“拉郎配”、“子配母”等高度近亲的繁衍方式和自然选择，形成了一种体型小、增重甚慢的矮小品种，当地有“三年不到五十斤”之称，是获得近交系小型猪的优良材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得近交系小型猪的方法，利用该方法生产的小型猪毛色基因已不分离，可作为比较医学合格的实验动物，满足生命科学发展的需要。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种获得近交系小型猪的方法，是将五指山小型猪进行全同胞、亲仔或祖孙三世代内近交繁育8代以上。
为了得到更好的效果，近交繁育最好在10代以上。
利用上述方法生产得到的近交系小型猪被命名为WZSP，其群体近交系数高达0.965以上，是目前世界上报导的近交系数最高的品系之一。利用本发明的方法得到的近交系小型猪体型小、体重轻、生长发育极为缓慢(6月龄13.43+3.27kg；24月龄36.65+9.17kg)、性成熟早、遗传稳定并能近亲繁殖；同时该近交系小型猪多种血液生理生化值近似人类，心脏冠状动脉前降支分布与中国人第二型(占90％)非常相似。WZSP白血球分类中淋巴细胞含量(75％)显著高于普通猪(52％)和人类(25-35％)。通过白细胞抗原血清学(SLA)研究，发现其C位点出现W2抗原、B位点出现W6抗原，这种组成在其它品种猪中均未曾发现。发明人通过对50多种影响肉质及风味特异性物质研究发现，WZSP的喹啉酸和丙二酸乙基戊基脂含量分别高于普通猪肉8倍和20倍，微卫星DNA标记研究发现SW2，103bp；W70，264bp；SW936，85bp；SW874，189bp；SW61，210bp位点为WZSP特有的遗传标记，为其具有体型小，性成熟早，肉质好等种质特异性提供了分子遗传学理论基础。
通过对WZSP分子遗传学特异性的研究发现WZSP DNA指纹图具有极奇一致的特异性；生长激素基因序列与普通猪(Vize.1990)有很大差异，即内含子III区有连续14个碱基的缺失，即TGGCAGAGGGCGGG；四个内含子区有6个碱基错位，它们是G，A，G，A，C，G；外显子区有3个碱基发生变化，并造成了3个氨基酸残基变化。它们是第2外显子中的第373位碱基G变为A，相应的密码子有CGG变为CAG，氨基酸有带正电荷的极性氨基酸Arg变为不带电荷的极性氨基酸Gln；第4外显子中的第1149位碱基A变为G，相应密码子由CAG变为CGG，氨基酸由不带电荷的极性氨基酸Gln变为带电荷的极性氨基酸Arg(Q121R)；第5外显子中的第1574位碱基A变为G，相应密码子由GAC变为GGC，氨基酸由带负电荷的极性氨基酸Asp变为不带电荷的极性氨基酸Gly(D168G)。MHSn(应激反应)基因频率为0(0/44)；分离、克隆的221bp片段(长白猪、枫泾猪无)为其特有片段，是其特异性遗传标记，该221bp片段的序列已测出(不能公开)，其碱基序列如下CATAGGAAGG TTAAT AATTT AGTAT GGTTT TTAAA ATTCC CCTTC CATTT TTATCTACCC ATTTG AAAAT TATAT ATACC TATAC CTTCA CACAG TCCTC CACTGACACA GTTCA TACAT TAATA GCTCT AGTAT ATCTA GAGAG TAGTT TACTGCTGTC ATGTT TATAT ATTCT CTAAT TCTTG GCCAA AAAAA AAAAA AATTACCAAC AGATC AGTAC C。RALP研究证实WZSP近交繁育可靠，遗传高度同质。
利用本发明的方法获得的近交系小型猪是畜牧兽医、营养代谢、胚胎工程、生物技术、人类比较医学研究的理想素材，在人类比较医学研究、人类异种器官移植基础性研究中，将发挥出特有的、难以估量的作用。目前已经在皮肤、口腔、心血管、肝、肾等方面进行了开发利用，取得了一定的进展。
具体实施例方式
实施例1、全同胞交配生产近交系小型猪利用同窝1公1母(因另1头母猪6月龄死亡)，进行世代近交，共进行了15世代，0-5世代近交窝产仔数为6-8头；6世代窝产仔数为5.5±0.50(n＝3)；7世代窝产仔数为5±2.0(n＝1)；8世代窝产仔数为5(n＝1)；9世代窝产仔数为4.5±2.0(n＝4)，而且出现死胎、木乃伊占33.33％(8/16)；10世代窝产仔数为4.5±0.83(n＝6)，死胎、木乃伊7.41％(2/27)，仔猪成活率为22.22％(6/27)；11世代窝产仔数为5.09±0.86(n＝11)，死胎、木乃伊1.79％(1/56)，仔猪成活率为48.21％(27/56)；12世代窝产仔数为5.63±2.50(n＝8)，仔猪成活率为46.07％(21/45)；13世代窝产仔数为5.63±0.875(n＝8)，发育不全占4.44％(2/45)，仔猪成活率为53.33％(24/45)；14世代窝产仔数为5.75±1.00(n＝6)，仔猪成活率为66.67％(22/33)；15世代窝产仔数为4.88±1.86(n＝8)，发育不全占7.69％(3/39)，仔猪成活率为66.67％(26/39)。
从实验结果可以看出1、近交对WZSP繁殖力影响较大；2、第9代仔猪成活率较低，随着近交代数的增加，仔猪成活率逐渐提高，死胎、木乃伊比例逐渐降低，其窝产仔数亦有增加的趋势；3、300余头WZSP近交后代未出现杂毛现象，其毛色特征表明，经过8代近交后其毛色基因已达到高度纯合的程度。
在上述实施例中，利用父女、母子或祖孙三世代内近交繁育，结果是相同的。
实施例2、WZSP世代DNA指纹图谱研究利用33.6，33.15探针进行的世代DNA指纹图谱研究。其基本过程是首先从五指山小型猪群体中随机抽取8头猪，用探针33.6和33.15进行DNA指纹分析。每个样品都酶切8-10μg DNA，然后电泳分离、碱法转移到尼龙膜上。探针按随机引物发用α-32pdCTP进行标记；杂交液为0.5mol/LPO4(PH7.2)，7％SDS，1mmol/L EDTA(PH8.0)；膜在杂交液中预杂交1-2hr后按1-2×106cpm/ml加入变性的探针杂交15hr后左右。杂交温度和洗膜条件因探针而异。
结果显示近交第8代个体间DNA指纹图F值为0.678，第8代与第9代间的数值为0.785，第9代与第10代间的数值为0.855，第10代个体间的数值为0.906。表明其近交代数与DNA指纹图谱F值变化相符；WZSP随着近交代数的增加，其DNA指纹图谱F值不断升高，证明了近交繁育的可靠性和准确性。
实施例3、WZSP近交家系基因纯合度研究1、STR研究利用18个微卫星对WZSP近交系进行遗传基因纯和度及同质化进行研究。首先进行猪血样基因组总DNA的提取，PCR引物的选择，PCR反应条件的确定，再对PCR产物进行检测，最后进行微卫星DNA的多态性分析。18个猪微卫星DNA的特性如下
结果表明WZSP近交家系基因已高度纯合，家系F14代，18个微卫星位点的平均有效等位基因数为1.8967(普通种猪每个微卫星位点的平均有效等位基因数为6个以上)，基因纯合率为0.6888，杂合度为0.3112(普通种猪为0.53-0.67)；并有2个位点(SW2409，SW445)等位基因频率已达到100％的纯合，另有3个位点(SW2，S0070，SW2612，SW71)等位基因频率已达到91.7％的纯合；SW2 103bp，S0070 264bp，SW93685bp，SW874 189bp和SW61 210bp位点，为WZSP特有的遗传标记。
2、RAPD研究RAPD技术建立在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增基础上，它利用一系列不同的随机排列碱基书许的寡核苷酸单链(一般为10碱基聚合体)为引物，对所研究基因组进行扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，从而检测扩增产物片段的多态性。本研究，利用36个探针对WZSP近交系进行遗传基因纯和度及同质化进行研究。探针的序列为
结果是每一探针得到1-6条带。证实WZSP近交系等位基因达到了高度纯合的程度。
权利要求
1.一种获得近交系小型猪的方法，是将五指山小型猪进行全同胞、亲仔或祖孙三世代内近交繁育8代以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述近交繁育10代以上。
全文摘要
本发明公开了一种获得近交系小型猪的方法，利用该方法生产的小型猪毛色基因已不分离，可作为比较医学合格的实验动物，满足生命科学发展的需要。本发明的技术方案是将五指山小型猪(Wu Zhishann Miniature Pig)进行全同胞、亲仔或祖孙三世代内近交繁育8代以上。为了得到更好的效果，近交繁育最好在10代以上。利用本发明的方法获得的近交系小型猪是畜牧兽医、营养代谢、胚胎工程、生物技术、人类比较医学研究的理想素材，在人类比较医学研究、人类异种器官移植基础性研究中，将发挥重要作用。
文档编号A01K67/027GK1502231SQ02149030
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者冯书堂 申请人:中国农业科学院畜牧研究所