专利名称：白桂木的离体繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的离体繁殖方法，具体是涉及白桂木的离体繁殖方法。
背景技术：
1994年，我国先后公布了《中国生物多样性行动计划》和《中国21世纪议程》，其中指出“中国动植物种类中已有15％-20％受到威胁，高于世界10％-15％的水平”。我国的植物资源十分丰富，约有3万多种，以此推算我国约有4500-6000种植物处于濒危或受到威胁。据报道，其中一些种群仅存一株或几株。我国从80年代起开始建立“全国珍稀濒危植物种质基因资源库及数据库”，91年公布了《中国植物红皮书》(第一册)。对濒危珍稀植物保护与保存主要有迁地保存(植物园)、就地保存(自然保护区)和离体保存等几种，其中，离体保存中的组织培养(in vitro culture)方法是近年发展起来的保护方法之一，特别对热带地区植物种质保存具有重要意义，是物种保存的重要手段之一。如国际遗传委员会(IBPGR)在英国皇家植物园已开始了对东南亚重要材树种龙脑香科植物的离体保存研究，该园还利用微繁殖对兰类(orchids)及蕨类(ferns)植物开展了离体保存实践。
白桂木，又名糖桂木、狗囊。学名Artocarpus hypargyreus Hance，桑科(Moraceae)，桂木属(Artocarpus)常绿乔木，高可达十余米。叶革质，互生，椭圆形或倒卵状长圆形，长7-22cm，宽3-8.5cm，顶端渐尖或短渐尖，基部楔形，全缘，但嫩叶常为羽状浅裂，腹面无毛而有光泽，背面密被灰白色短绒毛，侧脉7-9对和网脉均在背面凸起；叶柄长1-2.2cm，有短毛。花序单个腋生，雌雄同株雄花序倒卵形或棒状，长1.5-2cm，橙黄色，外被褐色短柔毛。雌花序园头状。聚花果近球形，直径3-4cm，黄色，干时褐色，有短毛，表面有不明显宿存的乳状凸起，萼片近轴部分分离，结果时约12片；果柄长3.5-6.5cm，有短毛。花期夏季；果期5-7月。主要分布于广东、香港、海南、广西、云南、湖南、江西、福建等省区。白桂木为喜光、喜湿树种，散生于我国南方各省受带季风影响的低海拔至中海拔丘陵或山谷疏林中。
果味酸甜可食或用于调味的配料或糖渍，种子民间作为果仁食用；木材坚硬，纹理通直，可供建筑家具等用材。(《广东植物志》，1987年版，第一卷)。
桑科植物种子为顽拗型种子，通常认为该类种子与正常种子比，含水量高，不能进行干燥处理，在日常湿、温条件下干燥也会很快丧失生命力，其种子含水量低于一定的含水量(安全临界含水量)时，种子将失去发芽力，这种种子需要在潮湿的环境保存。我们的实验表明，白桂木的种子发芽率低，经日晒干燥后基本不发芽，这与顽拗型种子的特性是相符的。白桂木为喜光、喜湿树种，在幼苗阶段还需一定的荫蔽条件。根据对生长于东莞市白桂木孤立木(本实验采种母株，该树为村边风水树)和对散生于次生林中的或在风水林中的白桂木(成株)的考察，孤立木四周不见有白桂木小苗，而次生林中的成年白桂木周边则有少量的不同年龄的白桂木分布。白桂木的这一种分布特点与其生理特性是一致的。据调查，多年来当地群众对成年的白桂木采种后进行多种方法的播种尝试，都没有获得成活的植株。白桂木种子苗分化严重，在自然条件下播种，种子极易被动物吃掉，这可能与白桂木种子苗中含有丰富的营养成分有关。如此种种，无疑大大减少了白桂木种群的自然繁殖率，使其生存受到威胁。
此外，白桂木主要生长于低海拔至中海拔地区，而人们又有将其用于药用、食用的习惯，因此，白桂木受人为干扰较大，这又加速了白桂木的濒危。
近年来的研究结果认为稀有、濒危和灭绝的生物就是它们在进化过程中存在某种脆弱的环节，如主要是繁殖系统的缺陷或基因漂变和某些物种的生物-生态学特性的特化而依赖于单一或特殊的环境、生境。这样，近代急剧变化的环境和特殊生境的消失，使它们来不及产生新的变异去适应。
白桂木的离体繁殖方法在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白桂木的离体繁殖方法，对受威胁的濒危植物白桂木进行离体组培快繁殖技术的研究，以抢救该物种，使其种群得以繁衍扩大，无论是对生态环境的保护还是对白桂木的进一步开发利用均具有重大的生态、社会、经济效益。
为达到上述目的，本发明采取了以下的技术方案白桂木的离体繁殖方法，依次由以下步骤组成(1)、无菌外植体的获得；以完整植株的茎尖、茎段、叶片为外植体；将茎尖、茎段用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理20min，无菌水冲洗3～5次，0.1％升汞处理5～10min，无菌水洗3～5次，茎尖切成长约1.5cm切块接种到诱导培养基中；叶片用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理30s，无菌水冲洗3～5次，0.1％升汞处理5～8min，无菌水洗3～5次。叶片切成1cm×2cm的切块接种到诱导MS培养基中；接种时间为35天；(2)、芽的诱导；用培养基对(1)步骤中获得的无菌外植体进行培养，产生丛芽，培养基为改良的MS；(3)、芽的增殖；将茎诱导出的直径约0.1～0.2cm，高约0.3～0.5cm的再生芽切下，接种到培养基中进行继代培养，茎尖开始时基部膨大，颜色开始转为淡黄色，并长出淡黄色到淡绿色的小芽，这些小芽培养约20～25天长出绿色叶片，长成直径约0.1～0.3cm，高为0.5～1.5cm的从芽；(4)、根的诱导与培养；将生长于继代培养基中的高0.5～1.0cm、带1～2片叶的从芽切成单芽接种到含MS培养基中培养，培养时间为30～50天，诱导出生根苗；
(5)、试管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培养室外或即将移栽的荫棚内练苗约10～15天，洗净试管苗附着的培养基，种植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基质或河沙中，苗床遮荫70～80％，保持空气湿度50～80％以上，温度保持在22～35℃，移栽后每3天喷施1/2MS营养液，每7～10天喷施800～1000倍的百菌清等杀菌剂，移栽后约一个月植株长出新根；待苗长出3-4片叶片，高约5cm即可移植到营养杯中，基质采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮荫40～60％的室外，并逐渐移去遮荫网，新根长出，苗高约≥25cm，即可定植；所述的外植体为母株种子苗优株的茎尖、茎段、叶片。
所述的外植体也可以采用无菌播种所得的实生苗的茎尖、茎段、叶片。
上述无菌播种的方法如下种子采后马上用自来水冲洗，晾干，第二天用70％酒精处理10～15秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分钟；无菌水冲洗五次后接种到MS培养基中，置培养箱中黑暗培养，温度保持在28℃，培养时间为30天，30天后长出具有根、茎、叶的完整植株。
同已有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明对受威胁的濒危植物白桂木进行离体组培快繁殖技术的研究，以抢救该物种，使其种群得以繁衍扩大；并利用离体组培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的优良组培苗，对保存和保护濒危植物白桂木并对其加以开发利用具有重要的生态、社会和经济效益。
下面结合附图对本发明做进一步的说明附图1为本发明的主要技术路线示意图。
具体实施例方式实施例1白桂木的离体繁殖方法，依次由以下步骤组成(1)、无菌外植体的获得；以母株种子苗优株的茎尖、茎段、叶片为外植体；将茎尖、茎段用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理20min，无菌水冲洗5次，0.1％升汞处理10min，无菌水洗4次，茎尖切成长1.5cm切块接种到诱导培养基中。母株茎的成功率3％，一年生的茎成功率在5％。材料接种的7天内，有的切口有淡褐色的物质分泌出来并有水浸状，这样的材料慢慢会死去，有的则转为绿色，切口处膨大，但无愈伤组织，在接种约25天后开出小芽。叶片用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理30s，无菌水冲洗4次，0.1％升汞处理8min，无菌水洗4次。叶片切成1cm×2cm的切块接种到诱导培养基中；接种时间为35天，成功率在30％。从叶诱导的芽的生长与茎的相似，但小芽从叶柄和叶片的切口长出。
(2)、芽的诱导；用培养基对(1)步骤中获得的无菌外植体进行培养，产生丛芽，培养基为改良的MS；(3)、芽的增殖；
将茎诱导出的直径0.15cm，高0.4cm的再生芽切下，接种到培养基中进行继代培养，茎尖开始时基部膨大，颜色开始转为淡黄色，并长出淡黄色到淡绿色的小芽，这些小芽培养25天长出绿色叶片，长成直径0.2cm，高为1.0cm的从芽；(4)、根的诱导与培养；将生长于继代培养基中的高0.8cm、带2片叶的从芽切成单芽接种到含基本培养基为1/2MS，含不同的浓度的NAA、IBA、IAA、或活性炭的培养基中培养，结果如下(表1)。实验均诱导出生根苗，但生根率有较大的差别，其中接种在NAA为0.05和加入活性炭组为最好，30天后植株基部长出粗壮新根，植株长高，根长为0.5-2cm，生根率分别为90、92％(表2)。但NAA过高则抑制了根的生长。我们在实验中还发现，接种在NAA为0.5或活性炭培养基中进生根的单芽若高≥0.5cm都能生根，且平均生根率都可达90％，较小的苗在生根阶段仍继续生长，但其出瓶的苗若根数≥1条，高约≥1.5cm，则成活率高达85.6％，但若单芽太小〔高约＜1.0cm＝，即使已生根，移栽的成活率则只有57.4％(表3)。因此，如果进入根的芽较高(≥0.8cm)，则生根阶段约30天即可出瓶，若接种的芽较小(高约0.5cm)，则生根阶段要60天，待苗高≥1.5cm才可出瓶。根据白桂木的这一生根特点来进行生产的安排。
表1生根实验培育基表
说明基本培养基为1/2MB，生长调节剂及活性炭用量单位为mg/L。
表2白桂木根的诱导生根率统计表
(5)、试管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培养室外或即将移栽的荫棚内练苗约14天，洗净试管苗附着的培养基，种植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基质或河沙中，苗床遮荫75％，保持空气湿度80％，温度保持在32℃，移栽后每3天喷施1/2MS营养液，每8天喷施900倍的百菌清等杀菌剂。移栽后约一个月植株长出新根，移栽成活率为77.7-95.1％，平均为85.6％(表3)，从我们2003年3月7日出瓶的成活率来看，以6月的成活率最高，且苗高≥1.5cm的成活率显著大于苗高＜1.5cm的瓶苗。待苗长出4片叶片，高5cm即可移植到营养杯中，基质采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1。杯苗置遮荫60％的室外，并逐渐移去遮荫网，新根长出，苗高≥25cm，即可定植。至2003年8月，我们已出瓶苗3000多株，其中室外筛苗1608株，可供定植的500多株。
表3白桂木成苗率统计表
实施例2方法与实施例1相同，但其步骤(1)中的外植体是采用无菌播种所得的实生苗的茎尖、茎段、叶片。这种方法较之实施例1而言速度较快。
上述无菌播种的方法如下种子采后马上用自来水冲洗，晾干，第二天用70％酒精处理10～15秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分钟；无菌水冲洗五次后接种到MS培养基中，置培养箱中黑暗培养，温度保持在28℃，培养时间为30天，30天后长出具有根、茎、叶的完整植株。
2002年8月采集种子26粒，种子采后马上用自来水冲洗，晾干，第二天用70％酒精处理12秒，无菌水冲洗4次，再用0.1％升汞消毒3分钟；无菌水冲洗五次后接种到1/2MS培养基中，置培养箱中黑暗培养，温度保持在28℃，培养时间为30天，30天后有23粒种子出芽，并长出具有根、茎、叶的完整植株。
结论关于离体培养1、白桂木的茎、种子的表面平滑，在实验中用一般的消毒方法，无论用上述的哪一种材料均较易得到无菌外植体，但从保持母本的遗传性状来考虑，应以优良母株的茎来诱导芽。
2、在芽的诱导中，用常用的MS培养基，曾试用与6-BA、KT、NAA、IBA、ADE、ZT等生长调节剂搭配及其多种梯度的组合实验，材料有的不萌动、有的变褐，均无法诱导出芽，后来我们用改良的MS(及上述的MB)培养基，则诱导出大量的从芽，推测白桂木的从芽的生长需要特定的营养。
3、实验表明，在生根培养基中，小芽(高约0.5cm、直径约0.1cm)与大芽(高约1.5cm、直径约0.3cm)生根率并无多大的差别，均可达90％以上。但对于较大(高大于1.5cm)生根苗，即使只有一条根，仍可成活，而对于较小的瓶苗(高约0.5cm、直径约0.1cm)，即使有3-4条根，最后仍干枯而死。这表明白桂木的小苗生长要有充分的养分积累。
权利要求
1.白桂木的离体繁殖方法，其特征在于该方法依次由以下步骤组成(1)、无菌外植体的获得；以完整植株的茎尖、茎段、叶片为外植体；将茎尖、茎段用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理20min，无菌水冲洗3～5次，0.1％升汞处理5～10min，无菌水洗3～5次，茎尖切成长1.5cm切块接种到诱导培养基中；叶片用自来水冲洗干净后，用70％酒精处理30s，无菌水冲洗3～5次，0.1％升汞处理5～8min，无菌水洗3～5次。叶片切成1cm×2cm的切块接种到诱导MS培养基中；接种时间为35天；(2)、芽的诱导；用培养基对(2)步骤中获得的无菌外植体进行培养，产生丛芽，培养基为改良的MS；(3)、芽的增殖；将茎诱导出的直径0.1～0.2cm，高0.3～0.5cm的再生芽切下，接种到培养基中进行继代培养，茎尖开始时基部膨大，颜色开始转为淡黄色，并长出淡黄色到淡绿色的小芽，这些小芽培养20～25天长出绿色叶片，长成直径0.1～0.3cm，高为0.5～1.5cm的从芽；(4)、根的诱导与培养；将生长于继代培养基中的高0.5～1.0cm、带1～2片叶的从芽切成单芽接种到含MS培养基中培养，培养时间为30～50天，诱导出生根苗；(5)、试管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培养室外或即将移栽的荫棚内练苗10～15天，洗净试管苗附着的培养基，种植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基质，或河沙中，苗床遮荫70～80％，保持空气湿度50～80％以上，温度保持在22～35℃，移栽后每3天喷施1/2MS营养液，每7～10天喷施800～1000倍的百菌清等杀菌剂，移栽后一个月植株长出新根；待苗长出3-4片叶片，高5cm即可移植到营养杯中，基质采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮荫40～60％的室外，并逐渐移去遮荫网，新根长出，苗高≥25cm，即可定植；
2.根据权利要求1所述的白桂木的离体繁殖方法，其特征在于所述的外植体为母株种子苗优株的茎尖、茎段、叶片。
3.根据权利要求1所述的白桂木的离体繁殖方法，其特征在于所述的外植体采用无菌播种所得的实生苗的茎尖、茎段、叶片。
4.根据权利要求3所述的白桂木的离体繁殖方法，其特征在于上述无菌播种的方法如下种子采后马上用自来水冲洗，晾干，第二天用70％酒精处理10～15秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分钟；无菌水冲洗五次后接种到MS培养基中，置培养箱中黑暗培养，温度保持在28℃，培养时间为30天，30天后长出具有根、茎、叶的完整植株。
全文摘要
本发明公开了白桂木的离体繁殖方法。该方法由以下步骤组成(1)无菌外植体的获得、(2)芽的诱导、(3)芽的增殖、(4)根的诱导与培养、(5)试管苗的移栽。本发明对受威胁的濒危植物白桂木进行离体组培快繁殖技术的研究，以抢救该物种，使其种群得以繁衍扩大；并利用离体组培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的优良组培苗，对保存和保护濒危植物白桂木并对其加以开发利用具有重要的生态效益、社会效益和经济效益。
文档编号A01H4/00GK1557142SQ20041001509
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月13日 优先权日2004年1月13日
发明者刘颂颂, 叶永昌, 招晓东 申请人:东莞市林业科学研究所