专利名称：获得大菱鲆优质受精卵的方法
技术领域：
本发明属于大菱鲆养殖繁育技术，是一种在亲鱼培育和采卵授精中获得大菱鲆优质受精卵的方法。
背景技术：
大菱鲆自1992年引入中国以来，获得了苗种繁育和养殖的成功，已在我国北方沿海形成了大菱鲆的养殖产业，但大菱鲆产卵质量的不稳定，卵子质量差，已严重制约了大菱鲆产业的发展。如何获得优质受精卵是亟待解决的问题。在本发明做出之前，对于获得大菱鲆优质受精卵的综合技术还没有相关报道。国际上关于捕获大菱鲆受精卵的胚胎发育有研究报道，但在如何获得优质受精卵并没有提供相关技术，法国布雷斯特渔业研究中心的N.Devauchelle(1988)研究了捕获大菱鲆的产卵，在文中仅对大菱鲆受精卵进行了生化分析，并探讨了受精卵的初步发育。黄海水产研究所雷霁霖、马爱军等(2003)详细研究了大菱鲆的胚胎及仔稚幼鱼发育。英国康威渔业研究所的Howell，B.R.1989.发现大菱鲆卵子存在过熟现象。过熟的受精卵将导致卵质和受精卵质量下降。上述研究，他们都是集中在卵子的生化组成和胚胎发育等方面的研究，而并没有提出如何获得优质受精卵的综合技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得大菱鲆优质受精卵的技术，是在亲鱼培育和人工授精技术的过程中，通过关键环节技术措施的掌握，获得大菱鲆优质受精卵。
本发明是按以下技术方案实现的它的技术内容包括亲鱼培育和人工采卵授精两方面一、亲鱼的培育包括亲鱼的优选及培育条件、亲鱼的饲料及饲喂、亲鱼的水温、光照调控
1、亲鱼的优选及培育条件优选体色为正常体色的大菱鲆。大菱鲆雌鱼3-6龄，体重3000-6000克，全长达40-60厘米；雄鱼达2-6龄以上，体重达2000-5000克以上，全长30-50厘米；海水流水充气养殖，全周年水质条件变化情况为溶解氧为＞6.0mg/L，PH范围为7.8-8.，盐度为25-35‰，水温为8-20℃。
2、亲鱼的饲料及饲喂亲鱼的饲料为配制的人工配合饲料，蛋白质的适宜含量为≥45％；脂类的适宜含量为≥10％，其中∑n-3HUFA的适宜比例≥20％。
饲料的配制在100公斤配料物质中，按饲料原料及用量配制成半湿颗粒饲料其配料和用量是新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤。
亲鱼的饲喂日投喂2次，日投喂量为鱼体体重的2％-5％，应在繁殖季节前五个月就开始进行，整个繁殖季节保持投喂。
3、亲鱼的水温、光照调控在繁殖期到来的前五个月，将大菱鲆的水温控制在8-10℃左右，光照时间为8小时，光照强度为100-500Lx左右。先是经过两个月的低温的积累发育，再将光照时间由每天8小时逐渐增至每天16小时，水温由8℃逐步增至14℃，然后再经过连续2-3个月的人工调控，使亲鱼充分成熟，获得优质卵子。产卵期温度控制在13-14℃，光照时间16小时，光照强度在100-500Lx左右。
二、人工采卵授精1、人工采卵大菱鲆雌鱼的排卵间隔，多数在80-90h之间。在12-14℃时，人工采卵必需在大菱鲆雌鱼排卵后10小时之内挤卵。整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵。
2、人工授精操作先从两尾雄鱼挤精液放入烧杯中，然后挑选成熟的雌鱼挤卵，挤卵时擦干鱼体和器皿，防止水及排泄物的混入。然后按1×105粒卵加入1ml～2ml精液，快速搅拌均匀使精卵充分接触，再加入少量经沉淀沙滤的海水，使精液、卵子、水的体积比约为精液、卵子、水的适宜体积比为1∶200∶200，继续搅拌1分钟，然后静置5分钟，再加入海水，静置10～15分钟，待受精卵吸水膨胀后，清水冲洗1次～2次，放入2000ml量筒中，用海水使上浮卵和沉淀卵分离，记录上浮卵数，上浮卵经冲洗后放入孵化器中孵化。
本发明与已有技术对比其特点本发明是一种获得大菱鲆优质受精卵的综合技术方法。从大菱鲆亲鱼的培育到人工采卵授精，进行了全过程关键环节的综合控制。通过综合措施的采取，提高了卵子和受精卵的质量，经镜检每批卵的平均活卵率在87.8％，受精成功率为89.6％，。
实施方式大菱鲆是新引进的优良海水养殖品种，发展迅速，但技术尚不完善。大菱鲆在苗种生产过程中，卵子的质量和受精率极不稳定，受精率较低时不到10％，严重影响了大菱鲆苗种生产的进行。通过综合措施的采取，提高大菱鲆卵子和受精卵质量，受精成功率为89.6％。
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容本研究在山东蓬莱市海水鱼类养殖试验场进行，并实施了综合技术措施，具体过程如下首先进行大菱鲆亲鱼的培育和人工采卵授精方法的确定，然后进行亲鱼培育和人工授精的规模化繁育试验。
实施例一、大菱鲆亲鱼的培育和采卵授精方法的确定1、亲鱼培育方法的确定实验选用大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)亲鱼共40尾，分4个不同的试验组，每组4尾雌鱼，6尾雄鱼。每组有3个平行。亲鱼为优选的正常体色的健康大菱鲆，正常体色大菱鲆背面呈青褐色有骨质突起，腹面光滑呈白色。亲鱼的年龄雌鱼和雄鱼均为3龄。平均规格为体重2650±12.0g，全长45±4cm。置于12个20m3水泥池中进行流水充气养殖，养殖用水为地下海水与自然海水，经砂滤后混合使用，全周年水质条件变化情况为DO＞6.0mg/L，pH＝7.8-8.2，S＝30-32，T＝8-18℃。
亲鱼的水温光照调控挑选好的亲鱼，先在10℃的水温及8小时的光照条件下培育2个月。之后培育水温由8℃以每天0.5℃的速度逐渐增至14℃，光照时间也由每天0.5h的速度渐增至16个小时，光照强度为400LUX。
亲鱼的饲料及饲喂亲鱼饲料为配制的人工配合饲料，蛋白质的适宜含量为≥45％；脂类的适宜含量为≥10％，其中∑n-3HUFA的适宜比例≥20％。
实验配制配合饲料实验设计了4组实验饲料，分别投喂4组亲鱼，每日投喂1～2次。
1)、实验组1饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉35公斤、豆粕18公斤、花生粕10公斤、面粉15，麦麸6，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油8公斤。
2)、实验组2饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉40公斤、豆粕20公斤、花生粕10公斤、面粉10，麦麸3，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油9公斤。
3)、实验组3饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉50公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、面粉10，麦麸2，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油10公斤。
4)、实验组4饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤配制的人工配合饲料经生化分析，结果见表1和表2.
表1 大菱鲆亲鱼4组试验饲料的蛋白、脂肪、能量组成项目 试验组 试验组 试验组 试验组1 2 3 4蛋白质(％) 40.6 45.5 47.949.3脂肪(％) 9.910.2 12.414.6能量(kJ/100g)113119115 108
表2 大菱鲆亲鱼4组试验饲料脂类脂肪酸组成饲料组脂肪酸(％)1 2 3 4C14:0 5.84.32.91.6C16:0 23.3 21.5 17.4 10.7C16:1 5.86.02.02.8C18:0 4.93.87.86.5C18:1 19.9 14.1 15.1 10.4C18:2(n-6)10.0 8.97.25.9C18:3(n-3)0.60.80.91.3C18:4(n-3)0.20.10.20.2C20:1 11.6 12.3 4.55.7C20:3(n-6)1.31.00.60.9C20:4(n-6)0.50.30.20.9C20:5(n-3)6.48.710.9 10.8C22:4(n-6)2.81.84.75.6C22:5(n-3)2.01.82.22.4C22:6(n-3)10.3 11.0 13.0 16.1∑n-3HUFA18.721.5 26.1 29.3试验结果经过5个月的投喂，不同试验组雌鱼产卵的结果见表3和表4表3各组亲鱼的产卵的主要指标项目 实验组1 2 34平均每尾产卵量0.68×1061.21×1061.36×1061.45×106卵径(mm)0.9991.0231.0361.053平均活卵率(％ ) 60 78 80 92.2
表4 各亲鱼组所产卵子脂类主要脂肪酸的组成百分比(％)脂肪酸亲鱼组1 2 3 414:0 3.553.553.353.4916:0 14.93 14.93 15.51 15.6916:1 10.38 10.38 11.76 10.0118:0 10.56 7.567.655.5518:1 36.23 37.00 30.00 25.3818:2(n-6)6.026.024.805.9018:3(n-3)3.973.8 1.381.0618:4(n-3)2.372.011.972.2020:1 1.091.121.581.1520:3(n-6)0.260.451.391.6720:4(n-6)0.410.801.101.5320:5(n-3)0.410.514.244.9822:4(n-6)3.752.982.442.0422:5(n-3)1.241.202.092.5022:6(n-3) - 2.145.3912.90∑n-3HUFA1.653.8511.72 20.38从试验结果中筛选出试验组4的人工配合饲料投喂亲鱼，可获得优质卵子。试验组4亲鱼培育人工饲料的的配制如下在100公斤配料物质中，其饲料配料及用量为新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤，配制成的饲料为半湿颗粒。
2、人工采卵授精方法的确定A、人工采卵试验组亲鱼10尾，通过光温调控和营养调控发育成熟，通过不同的采卵方式比较活卵率。
结果如下
试验结果表明大菱鲆在人工养殖条件下，很难自然产卵受精，且特殊的产卵方式使卵子极易过熟。大菱鲆特殊的排卵节律为大菱鲆雌鱼的排卵间隔，多数在80-90h之间。在12-14℃时，人工采卵必需在大菱鲆雌鱼排卵后10小时之内挤卵(在人工养殖条件下，大菱鲆雌鱼不能自然产卵，而是卵子成熟后先排到排卵腔中，然后再由人工将其卵子挤出)，才能保证优质卵子的获得。整个繁殖群体，经试验证明每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵，效果好，平均活卵率为90.2％。活卵指卵子是圆的，透明的，缺少卵周系，活卵率为活卵/总卵数。
B、试验人工授精操作方法精液、卵子、水的体积比的试验采卵，每100ml卵子为1组，共16个试验组，每组有三个平行。每个试验组加入精液(为了保证人工授精的质量，大菱鲆精液是从两尾雄鱼中采得。)不同的精液、卵子、水的体积比，及不同的受精时间，快速搅拌均匀使精卵充分接触，再加入少量经沉淀沙滤的海水，使不同试验组精液、卵子、水的体积比分别为1∶200∶200；1∶200∶100；0.5∶200∶200；0.5∶200∶100，使不同试验组配子接触时间分别为1～15分钟再加入海水，静置10分钟，待吸水膨胀后，清水冲洗2次，记录不同试验组受精率。
试验结果如下
试验结果表明精液、卵子、水的最佳体积比为1∶200∶200，配子接触时间以5分钟为宜。
实施例二、进行亲鱼培育和人工授精的规模化繁育试验。
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)亲鱼240尾，亲鱼为优选的正常体色的健康大菱鲆。亲鱼的年龄雌鱼和雄鱼均为3龄。平均规格为体重2700±15.0g，全长46±4cm。置于8个20m3水泥池中进行流水充气养殖，养殖用水为地下海水与自然海水，经砂滤后混合使用，全周年水质条件变化情况为DO＞6.0mg/L，pH＝7.8-8.2，S＝30-32，T＝8-18℃。
亲鱼的饲料及饲喂亲鱼的饲料为配制的人工配合饲料，由如下饲料原料及用量(在100公斤配料物质中)配制而成的半湿颗粒饲料新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤。亲鱼人工配合饲料的投喂时间是在2004年1月份开始进行的。整个繁殖季节保持投喂，日投喂2次。日投喂量为鱼体体重的2％-5％。
亲鱼的水温、光照调控2004年1-3月水温控制在8-10℃，目光照时间为8小时，光照强度为400LUX，自此时期起亲鱼进入强化培育阶段，开始投喂人工配合饲料。2004年3-5月份开始，水温由8-10℃逐步增至14℃。光照时间由每天8小时逐渐增至每天16小时，如此在温光调控和营养强化培育条件下，亲鱼性腺发育加快，2个月后，亲鱼性腺发育完全成熟，到5月出现排卵。
人工采卵经温光调控的亲鱼自5月初开始成熟、排卵，于5月中旬进入产卵高峰期，一直持续到6月底。整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵，以保证每次可采出优质的卵子。经镜检每批卵的平均活卵率在87.8％。
人工授精，大菱鲆精液从从两尾雄鱼中采得，精液、卵子、水的体积比为1∶200∶200。配子接触时间为5分钟，再加入海水，静置10～15分钟，待吸水膨胀后，清水冲洗1次～2次，放入2000ml量筒中，用海水使上浮卵和沉淀卵分离，记录上浮卵数，上浮卵经冲洗后放入孵化器中孵化。
在繁殖期内共获得1520万粒上浮卵，将获得的上浮卵进行脂肪酸含量的分析，其中∑n-3HUFA占脂肪酸含量的20.38％，平均受精成功率(4细胞数/活卵数)为89.6％，孵化率为50.8％。获得初孵仔鱼770万尾。
权利要求
1.一种获得大菱鲆优质受精卵的方法，它的技术内容包括亲鱼培育和人工采卵授精两方面亲鱼的培育包括亲鱼的优选及培育条件、亲鱼的饲料及饲喂、亲鱼的水温、光照调控；人工采卵授精包括人工采卵和人工授精操作，其特征在于它的亲鱼的培育方面1)、亲鱼的优选及培育条件优选体色为正常体色的大菱鲆。大菱鲆雌鱼3-6龄，体重3000-6000克，全长达40-60厘米；雄鱼达2-6龄以上，体重达2000-5000克以上，全长30-50厘米；海水流水充气养殖，全周年水质条件变化情况为溶解氧为＞6.0mg/L，PH范围为7.8-8.，盐度为25-35‰，水温为8-20℃。2)、亲鱼的饲料及饲喂亲鱼的饲料为配制的人工配合饲料，蛋白质的适宜含量为≥45％；脂类的适宜含量为≥10％，其中∑n-3HUFA的适宜比例≥20％。饲料的配制在100公斤配料物质中，按饲料原料及用量配制成半湿颗粒饲料其配料和用量是新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤。亲鱼的饲喂日投喂2次，日投喂量为鱼体体重的2％-5％，应在繁殖季节前五个月就开始进行，整个繁殖季节保持投喂。3)、亲鱼的水温、光照调控在繁殖期到来的前五个月，将大菱鲆的水温控制在8-10℃左右，光照时间为8小时，光照强度为100-500Lx左右。先是经过两个月的低温的积累发育，再将光照时间由每天8小时逐渐增至每天16小时，水温由8℃逐步增至14℃，然后再经过连续2-3个月的人工调控，使亲鱼充分成熟，获得优质卵子。产卵期温度控制在13-14℃，光照时间16小时，光照强度在100-500Lx左右。人工采卵授精方面1)、人工采卵大菱鲆雌鱼的排卵间隔，多数在80-90h之间。在12-14℃时，人工采卵必需在大菱鲆雌鱼排卵后10小时之内挤卵。整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵。2)、人工授精操作先从两尾雄鱼挤精液放入烧杯中，然后挑选成熟的雌鱼挤卵，挤卵时擦干鱼体和器皿，防止水及排泄物的混入。然后按1×105粒卵加入1ml～2ml精液，快速搅拌均匀使精卵充分接触，再加入少量经沉淀沙滤的海水，使精液、卵子、水的体积比约为精液、卵子、水的适宜体积比为1∶200∶200，继续搅拌1分钟，然后静置5分钟，再加入海水，静置10～15分钟，待受精卵吸水膨胀后，清水冲洗1次～2次，放入2000ml量筒中，用海水使上浮卵和沉淀卵分离，记录上浮卵数，上浮卵经冲洗后放入孵化器中孵化。
全文摘要
一种获得大菱鲆优质受精卵的方法，包括亲鱼培育和人工采卵授精两方面。亲鱼的培育包括亲鱼的优选及培育条件、亲鱼的饲料及饲喂、亲鱼的水温、光照调控；人工采卵授精包括人工采卵和人工授精操作。本发明从大菱鲆亲鱼的培育到人工采卵授精，是一套完整的综合控制技术方法，通过关键环节技术措施的掌握，可提高卵子的活卵率和受精成功率，获得优质的受精卵。240尾亲鱼，整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵，经镜检每批卵的平均活卵率在87.8％。获得受精卵的∑n－3HUFA占脂肪酸含量的20.38％，平均受精成功率为89.6％，孵化率为50.8％。
文档编号A01K61/00GK1647622SQ20051004244
公开日2005年8月3日 申请日期2005年2月1日 优先权日2005年2月1日
发明者马爱军, 陈超, 雷霁霖, 庄志猛, 王印庚 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所