一种金龟子高毒力Bt新菌株、新基因筛选和生物测定方法

专利名称：：一种金龟子高毒力Bt新菌株、新基因筛选和生物测定方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，具体的说，涉及一种金龟子高毒力Bt新菌株、新基因筛选和生物测定方法。
背景技术：
：金龟子属鞘翅目，金龟总科(Scarabaeoidea),其幼虫(俗称蛴螬)是一类重要的世界性难防治地下害虫，分布广泛，为害粮食、棉花、油料、蔬菜、糖料、烟草、牧草、花丼、草坪、果树等多种植物。据20年来的大量调查，其危害已居各类地下害虫之首，占地下害虫总虫量的80%以上。据统计每年全国鲚螬发生面积在1亿亩以上，产量损失约20%。1976、1977年，全国每年蛴螬发生面积达3.2亿亩，产量损失40%,有些地块甚至绝产，已成为生产上迫切解决的问题。为控制蛴螬的发生为害，我国植保科技工作者早在上世纪80年代以前进行了大量的研究工作，提出了运用农业、化学、物理等措施的综合防治策略，取得了一定的成效。随着种植结构和生态系的变化，地下害虫矫螬呈逐年猖獗趋势。目前我国金龟科地下害虫的防治现状依然严峻，生产上仍在使用高毒、高残留的"3911"、"1605"、"呋喃丹"等化学农药。由此引起的环境污染、残留增高、抗药性增强等一系列社会问题，已对我国土壤和水资源造成了极为严重的污染，严重影响着我国无公害、安全食品的生产，生产上急需研究金龟子有效的防治技术。苏云金杆菌(Bfl"7Zwsf/mnVjg/e"s"，简称Bt)是世界上研究最深入、应用最广泛的杀虫微生物。由于Bt菌株杀虫蛋白基因的多样性和特异性，决定了杀虫毒蛋白(InsecticidalCrystalProteins,简称ICPs)的杀虫谱及活性不同，就为筛选对不同种类金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株提供了广阔空间。1998年本课题组在我国首次筛选获得一株对丽金龟科幼虫高毒力的Bt新菌株HBF-l,并对其生物学特性进行了较深入研究，确定了其基因型为co;SC"。该菌株对丽金龟科幼虫具有高毒力，但对鳃金龟科幼虫的毒力较差。由于我国华北地区鲚螬以丽金龟科和鳃金龟科幼虫混杂发生为主，这就需要筛选对不同种类金龟子具有特异活性的Bt菌株，才能达到控制危害的目的。因此，利用Bt杀虫蛋白基因的多样性来筛选对金龟科幼虫高毒力的Bt菌株，不但可为我国持续有效的控制蛴螬的发生危害提供有效的生防菌株资源，而且也将为构建广谱高效的杀虫工程菌和转基因植物提供基因资源。为此本项发明依据金龟子防治和人工饲养中存在的问题，通过对饲养器具、饲养条件、饲养食料等方面的研究，确立了不同金龟子的人工饲养方法，达到了满足提供对金龟子高毒力Bt菌株筛选的生测用虫的要求。同时通过对金龟子生物测定的条件、器具、饵料等的优选，建立了完善的对金龟子高毒力Bt新菌株、新基因筛选和生物测定方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种金龟子高毒力Bt新菌株、新基因筛选和生物测定方法。为了实现本发明的目的，本发明提供了一种金龟子成虫的饲料，由下列原料组成干榆叶粉或干花生叶粉20g、琼脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0.5g、VclO片、复合Vb5片、等重量的NaCL和KCL组成的盐0.5g和水300mL。Vc片每片0.1克，复合Vb每片0.1克。本发明还提供了一种金龟子的人工饲养方法，包括如下步骤1)将金龟子成虫按雌雄数目1:1比例置于温度24-27。C,相对湿度50~70%，光照L13:Dll，2000~4000LX的养虫室中，养虫笼中土壤相对湿度18~20%，放入金龟子成虫的人工饲料或天然饲料饲养产卵，天然饲料每日下午更换一次，人工饲料每2天更换一次，每隔23天挑取卵l次，其中，所述天然饲料为鲜榆叶；2)将挑出的卵过40目筛，筛除多余的土，浸入0.2%的次氯酸钠水溶液中5分钟，然后用清水冲洗45次至无味，吸去多余水分；3)将土壤在日光下暴晒2天消毒，过20目筛后加水，使含水量为18~20%,接入步骤2)中处理后的卵，在25。C条件下孵化，也可在10~15"C条件下保存30~40d;4)在直径20cm的养虫盒中放入5cm的湿土(阳光下消毒2天，含水量18-20%),再放入发芽的玉米和马铃薯块(暗黑金龟幼虫放入发芽的花生)，供幼虫取食，将每日挑出初孵幼虫接入饲养盒中，每盒接入初孵幼虫100头，再覆盖35cm的湿土，置于2527。C条件下饲养1020天，作为生物测定的供试虫源；另外，按上述方法在250ml的塑料盒中接入初孵幼虫5头进行饲养，每2030天更换一次新土和食料，当幼虫生长到2龄未3龄初时，按上述方法分单头词养，以免幼虫之间相互残杀，作为室内常年词养虫种；5)伺养至3龄后期时，幼虫停止取食，体色变黄有皱紋，做蛹室准备化蛹，将已停食的幼虫单独饲养，这时可不加食料，并减少换土次数和过多的翻动，以免破坏蛹室影响化蛹，但应每5天打开盒盖观察有无成虫钻出的痕迹，一旦发现成虫羽化，及时将羽化的成虫辨别雌雄后挑入成虫饲养笼。本发明提供了一种苏云金杆菌对金龟子幼虫的高毒力新基因源的筛选方法，包括如下步骤生测饵料①马铃薯细丝，选新鲜马铃薯块切成细丝(2mt^粗细)，用水冲洗2遍后，控去多余水分；②发芽玉米根，将玉米在水中浸泡12小时，然后撒入湿土中让其生根发芽，待根长至3cm时挖出，用水冲去泥土备用；③发芽花生，将花生在水中浸泡12小时，然后在保湿的条件下12小时让其发芽备用(用于暗黑金龟子测定)；称取马铃薯丝40g(或玉米根边同玉米20粒、发芽花生20粒)，加入到40mL—定浓度为2xl()7孢于/ml的菌悬液中搅拌混合均勻，连同菌悬液倒入200g土中，放置2h,使土壤含水量为20%。先将生测铒料均匀分装于20个养虫管中，再加入拌匀的菌土，按照优选的生测条件，即釆用15日龄铜绿丽金龟幼虫、5日龄暗黑鳃金龟幼虫、3曰龄华北大黑鳃金龟幼虫，每管接幼虫i头，每一处理20头幼虫，重复3次，在3(TC、RH6(T/。的人工气候箱中感染饲养，使用的土壤为紫外线照射处理5h的壤土；调查记载方法分别于处理后7、14天调查幼虫的的死亡数量，计算幼虫死亡率。本发明提供了一种转cry基因植物对金龟幼虫抗性检测方法，包括如下步骤幼虫存活率鉴定法在直径15cm高15cm的花盆中种植转基因烟草或草坪草，种植约15天后，使之完全存活，选择生长一致的植株进行接虫试验，每一花盆接初孵金龟子幼虫5头，接虫后注意保持土壤的湿度，每一处理5盆，重复3次，以不转基因植株作为对照。接虫后15天调查幼虫的存活数量，计算各处理的幼虫死亡率，明确不同植株的抗虫效果;地下部分危害程度与抗虫性鉴定方法以烟草为鉴定对象，釆用分别种植pSmCN和pBI植株以及混合种植pSmCN、pBI、pTmCN、pTGN和对照山西烟的种植方法，每个处理12株，将转基因烟草各处理12株分别种植在48x33x13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm,每棵烟苗接20日龄的黄褐丽幼虫5头或15曰齡的铜绿丽金龟幼虫5头，在接虫15天后，按照分级标准，对各种烟草植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数；地上部分危害程度与抗虫性鉴定方法以草评草为鉴定对象，在48x33x15cm的塑料盒子中加土12cm，随机种植生长一致的转基因植株8株和对照植株4株，待植株生长15天后，使植株很好地存活，每穴草坪接20日龄的黄褐丽幼虫5头或15日龄的铜绿丽金龟幼虫5头，重复4次，在接虫15天后，按照分级标准，对各种植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数。本发明主要涉及对地下害虫高毒力苏金芽胞杆菌新基因的筛选，通过对不同种类金龟子的饲养，为新菌株的筛选提供生测虫源，建立一套适于苏云金芽胞杆菌新菌株的筛选方法，该方法的建立将针对不同种类的金龟子筛选出具有特异活性苏云金芽胞杆菌菌株资源，为研制地下害虫金龟子生物农药提供了科学依据。依据该方法将扩展苏云金芽胞杆菌的基因资源，同时确立了转Bt基因抗虫作物对金龟子幼虫的抗性鉴定方法，为进一步进行转Bt基因抗虫植物的培育奠定基础。达到可持续控制地下害虫金龟子危害的目的，具有广阔的应用前景。图l华北大黑鳃金龟成虫，成虫在田间交配。图2金龟子所产的卵和初孵的幼虫。图3人工饲养的金龟子幼虫(鲚螬)。图4以人工饲料饲养金龟子成虫，成虫正在取食。图5室内大量饲养的金龟子幼虫。图6对金龟子高效Bt生物测定操作。图7感染Bt的鲚螬和正常发育的鲚螬。图8不同土壤条件对铜绿丽金龟幼虫体重增长的影响。图9不同土壤条件对铜绿丽金龟幼虫死亡率的影响。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l人工饲料的配制成虫人工饲料配方榆叶粉或花生叶粉20g、琼脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0,5g、VclO片、复合Vb5片、等重量的NaCL和KCL组成的盐0.5g和水300mL。配制与饲养方法在500ml的烧杯中加入水，并放入琼脂，沸腾并溶化，先加入山梨酸，再加入混合均匀的其它成份，待温度降至60'C时加入维生素，充分搅拌均匀后，倒入培养皿中，在冰箱中保存待用。把人工饲料切成lxlx2cm的块，放在塑料纸上进行饲喂，根据成虫的数量确定放饲料的多少，依据取食情况可每2天更换一次饲料。其中，Vc片每片0.1克(石家庄庄制药集团产品)，复合Vb每片O.l克(天津金世制药有限公司)。实例2、金龟子成虫铜养与产卵金龟子成虫饲养的关键在于获得较多的卵量，为此在明确了成虫饲养器具和饲养条件的基础上，重点研究了不同食料对金龟子成虫产卵的影响，通过饲喂天然饲料(鲜榆叶，玉米苗、梨树叶、花生叶、大豆叶)、人工饲料(以榆叶粉、花生叶粉、大豆叶粉、白菜叶粉为主要原料配制)。饲养方法将雌雄成虫各10头放入饲养笼内，让其取食和产卵，每日更换一次饲料，并在取食前后对饲料进行称重，观察成虫的取食数量。每隔2d挑出卵，记载产卵数量。明确成虫取食对成虫产卵数量及寿命的影响。表l结果表明，华北大黑鳃金龟产卵数量与饲料的关系，配方l(榆叶粉)>配方2(大豆叶粉)>配方3(白菜叶粉)>配方4(花生叶粉)>配方5(玉米叶粉)〉鲜榆叶〉梨叶〉玉米叶〉草叶。在供试饲料中以取食人工饲料的产卵量明显高于天然词料，华北大黑鳃金龟最喜食配方l(榆叶粉)，平均单雌产卵50.4粒，次之是配方2(大豆粉)和配方3(白菜叶粉)。从取食量上看天然饲料高于人工饲料，华北大黑鳃金龟子取食量最大的饲料不一定是产卵最多的饲料，这与伺料中金龟子所需营养成份有关。多数金龟子成虫在产卵之前需补充营养，营养的好坏直接影响着金龟子的产卵数量和寿命。5个配方是单成分，而人工饲料是组合物表l不同饲料对华北大黑腮金龟产卵量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实例3卵的孵化与保存为了明确不同铜养介质对金龟子卵孵化的影响，进行了壤土、壤土+沙土、沙土、蛭石四种介质中进行卵的孵化的试验。结果见表2，结果表明四种饲养介质对卵孵化率无明显影响，以湿土最优，土壤湿度应掌握在用手捏后能自行散开为宜。在沙子中的卵孵化相对早一些，并且在其中的卵能吸收到充足的水分，以便其发育，而在砂子中挑取幼虫时易损伤小幼虫，在蛭石中挑取幼虫时不易发现幼虫。为了延长金龟子幼虫的生物测定时间，所以进行了金龟子卵在不同温度条件下的保存试验，如表3。结果表明5。C条件下的卵不宜长时期保存，1(TC可进行30d的保存，随着时间的加长卵的孵化率明显降低，30d的孵化率为48呢，而15。C条件下保存，虽对卵的孵化率影响较小，但到40d后，金龟子的卵在保存的温度下即可孵化。所以金龟子的卵可在10-15"条件下保存30-40d。表2不同介质对华北大黑鳃金龟卵孵化率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3不同温度条件下保存天数对卵的孵化率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实例4提高低龄幼虫存活率的方法金龟子幼虫在土中生长发育，极易受到病原微生物的感染，在低龄幼虫期就引起大量死亡，为了提高金龟子低龄幼虫的存活率，通过卵面0.2%次氯酸钠溶液处理和阳光晒土饲养的试验。结果表明金龟子卵面消毒后卵的孵化率达95%以下和不消毒卵的孵化率相当，卵消毒后不影响孵化，从对幼虫的影响看出，卵和土都消毒后幼虫的存活率最高达96.5%，如有一方面不消毒将增加幼虫的死亡率，所以通过卵面消毒和土壤消毒可减少土壤中昆虫病原微生物，提高幼虫的成活率。见表4。表4卵面消毒对幼虫成活率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实例5华北大黑鳃金龟幼虫对词料的选择以壤土为铜养介质，通过饲喂不同饲料，明确不同饲料对华北大黑鳃金龟各龄幼虫生长发育的影响，由表5可看出，词喂土豆幼虫成活率高，且体重增长最明显，由此看来，土豆适宜饲养华北大黑鳃金龟一龄、二龄幼虫，花生、玉米次之。人工饲料四个配方对低龄幼虫的成活率和幼虫体增重都很低，目前人工饲料与天然饲料相比，无论是存活率还是幼虫体重都明显低于天然饲料。因此，在华北大黑鳃金龟幼虫饲养中，依据幼虫的发育和饲养成本综合考虑，利用马铃薯块和发芽玉米根进行饲养最为适宜。表5不同饲料对华北大黑鳃金龟幼虫的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实例6不同土壤湿度对幼虫生长发育的影响分别设16%、18%、20%、22%4个土壤湿度，接入初孵金龟子幼虫，分别饲养20、40天后调查幼虫增重和死亡率，结果表明(表6)，在16%的土壤湿度条件下，金龟子幼虫生长慢；而22%土壤湿度下虽然生长速度快，可是死亡率高；18%、20%土壤湿度下金龟子幼虫生长发育状况良好，死亡率低，所以18%-20%的土壤湿度适宜金龟子幼虫的词养。表6不同土壤湿度对金龟子幼虫生长发育的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实例7Bt菌株生物测定条件的优选1、不同日龄幼虫的存活率比较分别挑取l、5、10、15、20曰龄的铜绿金龟幼虫，采用保定市东郊菜田壤土饲养，伺养3、7、14天后，比较各曰龄幼虫的死亡率。结果表明(表7),选择IO、15日龄幼虫进行生物测定能够保证死亡率较低，能保证生物测定的可靠性，而20天龄幼虫虽然死亡率较低,但由于随着幼虫长大，对苏云金杆菌的敏感性降低，不应作为被测幼虫。对不同曰龄的暗黑鳃金龟幼虫死亡率的调查中(表8),初孵幼虫7、14d的死亡率分别为1.4%、2.5%,5日龄幼虫死亡率在三天的调查中均为O。因此，采用5日龄幼虫进行生测较为适宜。华北大黑鳃金龟幼虫抗逆性较强，因此，初孵、3、5、10d的幼虫死亡率均为0(表9),采用3日龄的幼虫进行生测即可。表7不同日龄铜绿丽金龟幼虫的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9不同日龄华北大黑鳃金龟幼虫的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2不同土壤条件对幼虫存活率的比较釆用保定市东郊菜田壤土、定州巿西城区沙壤土以及保定涞源白石山松针腐殖土作为被测土壤，每种土壤设以下3个处理121。C湿热灭菌30min(S)、紫外线照射处理(40W,距离50cm,5h)(UV)、不处理(N)。比较IO曰龄幼虫在饲养7天、14天时的死亡率和平均体重增长率。通过以下3个处理121'C湿热灭菌(S)、40W紫外线照射处理5h(UV)以及不处理(N)后，接入铜绿丽金龟幼虫饲养，幼虫体重增长的情况见附图8。在7天时，腐殖土3个处理的幼虫体重增长率最低，壤土、沙壤土各处理之间差异不显著；14天时，腐殖土处理的幼虫体重增长率仍为最低，不处理的沙壤土幼虫体重增长率最高，其次为灭菌处理的沙壤土、紫外线处理的壤土。附图9可以看出，在7天时，紫外线处理的壤土和不处理的腐殖土幼虫死亡率为O。14天时，腐殖土各处理死亡率均偏高，而湿热灭菌处理的各土壤中幼虫死亡率均高于紫外线处理和不处理的对照，紫外线处理的壤土和沙壤土中幼虫死亡率最低，平均低于5.85%。实例8Bt菌株的标准化生物测定将Bt菌株在装有普通细菌培养基(蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠2g、葡萄糖3g、琼脂20g、蒸馏水1000mL)的克氏瓶中划线，3(TC培养至孢晶游离。用水洗下斜面培养物作为菌悬液，将40g马铃薯丝加入到20mL菌悬液中混合均匀，连同菌悬液倒入200g土中，放置2h,使土壤含水量为18%。先将马铃薯丝均匀分装于20个养虫管中，再加入拌匀的菌土，每管接虫l头，每一处理20头幼虫，重复3次。釆用1.4中优选的最佳虫龄和土壤条件进行生测，在3(TC、RH60。/。的人工气候箱中感染饲养，计算幼虫死亡率。按照优选的生测条件，即采用15日龄铜绿丽金龟幼虫、5曰龄暗黑鳃金龟幼虫、3日龄华北大黑鳃金龟幼虫和紫外线照射处理5h的壤土进行Bt菌株的生测，空白对照的幼虫死亡率在测定7天时为0，在14天时平均为0.0-2.8%±0.5%，Bt菌株的毒力测定结果重现性较好。通过对铜绿丽金龟子幼虫高毒力的苏云金杆菌菌株筛选中发现(表IO)，在供试的1082株Bt菌株中，有杀虫活性的菌株均为球形伴孢晶体，占被筛选菌株总数的7.3%。铜绿丽金龟幼虫死亡率达到100%的菌株占球形伴孢晶体菌株总数的0.8%,占被筛选菌株总数的0.3%,比如，HBF-1、H06菌株。因此，对铜绿丽金龟幼虫高毒力的苏云金杆菌菌株的筛出率是较低的。通过对华北大黑鳃金龟幼虫高毒力的苏云金杆菌菌株筛选中发现(表ll),在供试的369株供试菌株中，使华北大黑鳃金龟幼虫死亡率达到80-99%的占0.27%,比如HBF-18菌株，死亡率为60-79%的占1.08%,比如HF29、HF32、HF-28、FSH8等，对华北大黑鳃金龟幼虫高毒力的苏云金杆菌菌株的筛出率是极低的。通过对暗黑鳃金龟幼虫高毒力的苏云金杆菌菌株筛选中发现(表12)，在供试的210株供试菌株中，使华北大黑鳃金龟幼虫死亡率达到100%的菌株占12.4%,比如185、145、283、202、248、67、166等，死亡率为80-99%的菌株占16.7%。其中，Su4菌株对暗黑鳃金龟及铜绿丽金龟均有较高杀虫活性，达到80%以上。表10对铜绿丽金龟幼虫有杀虫活性的Bt菌株占分离的球形晶体Bt菌株的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表12对暗黑鳃金龟幼虫有活性的Bt菌株占分离的圆形晶体Bt菌株的百比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实例9转Cry基因烟草对金龟幼虫抗性检测方法按照建立的危害程度分级标准，黄褐丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数(图13)。PSmCN植株的危害率为61.1%,危害指数为20.8;pTmCN植株危害率为77.8%，危害指数为34.6,与PSmCN植株相当；pBI植株危害率100%,危害指数为70.8，与山西烟危害指数75相当。pSmCN植株和pTmCN植株表现出了良好的抗黄褐丽金龟幼虫的特性。铜绿丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数。PSmCN植株危害率为66.7%,危害指数为22.6;pTmCN植株危害率为50%,危害指数为13.9，低于PSmCN植株；pBI植株危害率为100%，危害指数为65.3，与山西烟危害指数70.8相当。pTmCN植株和pSmCN植株表现出了良好的抗铜绿丽金龟幼虫的特性。权利要求1、一种金龟子成虫的饲料，其特征在于，由下列原料组成干榆叶粉或干花生叶粉20g、琼脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0.5g、Vc10片、复合Vb5片、等重量的NaCL和KCL组成的盐0.5g和水300mL。2、一种金龟子低龄幼虫的人工饲养方法，包括如下步骤1)将金龟子成虫按雌雄数目1:1比例置于温度2427",相对湿度50~70%,光照L13:Dll，2000~4000LX的养虫室中，养虫笼中土壤相对湿度18-20%,放入金龟子成虫的人工饲料或天然饲料饲养产卵，天然词料每曰下午更换一次，人工饲料每2天更换一次，每隔23天挑取卵l次，其中，所述天然饲料为鲜榆叶；2)将挑出的卵过40目筛，筛除多余的土，浸入0.2%的次氯酸钠水溶液中5分钟，然后用清水冲洗45次至无味，吸去多余水份；3)将土壤在日光下暴晒2天消毒，过20目筛后加水，使含水量为18~20%,接入步骤2)中处理后的卵，在25'C条件下孵化，也可在1015。C条件下保存30~40d;4)在养虫盒中放入5cm的湿土(阳光下消毒2天，含水量18~20%),再放入发芽的玉米和马铃薯块(暗黑金龟幼虫放入发芽的花生)，供幼虫取食，将每日挑出初孵幼虫接入饲养盒中，每盒接入初孵幼虫100头，再覆盖35cm的湿土，置于2527X:，条件下饲养10~20天，作为生物测定的供试虫源；另外，按上述方法在250ml的塑料盒中接入初孵幼虫5头进行词养，每20-30天更换一次新土和自然饲料，当幼虫生长到2龄未3龄初时，按上述方法分单头饲养,作为室常年词养虫种；5)饲养至3龄后期时，幼虫停止取食，体色变黄有皱紋，做蛹室准备化蛹，将已停食的幼虫单独饲养，这时可不加食料，并减少换土次数和过多的翻动，以免破坏蛹室影响化蛹，但应每5天打开盒盖观察有无成虫钻出的痕迹，一旦发现成虫羽化，及时将羽化的成虫辨别雌雄后挑入成虫饲养笼。3、苏云金杆菌对金龟于幼虫的高毒力新菌株、新基因源的筛选方法，包括如下步骤生测饵料①马铃薯细丝，选新鲜马铃薯块切成细丝(2mn^粗细)，用水冲洗2遍后，控去多余水份；②发芽玉米根，将玉米在水中浸泡12小时，然后撒入湿土中让其生根发芽，待根长至3cm时挖出，用水冲去泥土备用；③发芽花生，将花生在水中浸泡12小时，然后在保湿的条件下12小时让其发芽备用(用于暗黑金龟子测定)；称取马铃薯丝40g(或玉米根边同玉米20粒、发芽花生20粒)，加入到40mL浓度为2xl(^孢子/ml的苏云金杆菌菌悬液中搅拌混合均勾，连同菌悬液倒入200g土中，放置2h，使土壤含水量为20%;先将生测铒料均匀分装于20个养虫管中，再加入拌匀的菌土，按照优选的生测条件，即釆用15日龄铜绿丽金龟幼虫、5日龄暗黑鳃金龟幼虫、3日龄华北大黑鳃金龟幼虫，每管接幼虫l头，处理20头幼虫，重复3次，在3(TC、RH6(T/。的人工气候箱中感染饲养，土壤使用紫外线照射处理5h的壤土；调查记载方法分别于处理后7、14天调查幼虫的的死亡数量，计算幼虫死亡率。4、转c77S基因植物对金龟幼虫抗性检测方法，包括如下步骤幼虫存活率鉴定法在花盆中种植转基因烟草或草坪草，种植后15天后待很好地存活后，选择生长一致的植株进行接虫试验，每一花盆接初孵金龟子幼虫5头，接虫后注意保持土壤的湿度，每一处理5盆，重复3次，以不转基因植株作为对照；接虫后15天调查幼虫的存活数量，计算各处理的幼虫死亡率，明确不同植株的抗虫效果；地下部分危害程度与抗虫性鉴定方法以烟草为鉴定对象，釆用分别种植pSmCN和pBI植株以及混合种植pSmCN、pBI、pTmCN、pTGN和对照山西烟的种植方法，每个处理12抹，将转基因烟草各处理12株分别种植在48x33xl3cm的塑料盒子中，土壤深度12cm,每棵烟苗接20日龄的黄褐丽幼虫5头或15曰龄的铜绿丽金龟幼虫5头，在接虫15天后，按照分级标准，对各种烟草植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数；地上部分危害程度与抗虫性鉴定方法以草坪草为鉴定对象，在48x33xl5cm的塑料盒子中加土12cm,随机种植生长一致的转基因植株8株和对照植株4株，待植株生长15天后，使植株很好地存活，每穴草坪接20日龄的黄褐丽幼虫5头或15日龄的铜绿丽金龟幼虫5头，重复4次，在接虫15天后，按照分级标准，对各种植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数。全文摘要本发明涉及主要种类金龟子的人工饲养方法，为高毒力Bt菌株的筛选提供生物测定的虫源。涉及对金龟幼虫高毒力Bt菌株筛选、生物测定、毒力比较的方法，进而获得了对铜绿丽金龟、黄褐丽金龟、华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟幼虫高毒力的HBF-1、HBF-18、185等菌株，同时明确了Cry8蛋白活性检测方法和转cry8基因植物对金龟子幼虫抗虫鉴定方法。本发明为金龟子幼虫的生物防治提供了菌株资源，也为抗金龟子作物的培育提供了基因资源。本发明为金龟子幼虫的室内饲养提供了适宜的饲养条件和饲养饲料，并为防治金龟子幼虫的高毒力Bt菌株、Cry蛋白及转基因植物的抗虫性鉴定提供了标准化的生测方法。文档编号A23K1/18GK101190006SQ20061014426公开日2008年6月4日申请日期2006年11月30日优先权日2006年11月30日发明者冯书亮,健宋,宋福平,杰张,曹伟平,杜立新,王容燕,王金耀,黄大昉申请人:河北省农林科学院植物保护研究所