专利名称：草坪草转化子的抗生素筛选临界浓度的确定方法
技术领域：
本发明涉及转基因草坪草转化子的筛选方法，特别是抗生素筛选临界浓度的确定方法。
背景技术：
草坪草具有保持水土、改造自然、美化环境等功能。草坪的首要需求来自城市绿化、净化。随着城市化、工业化进程的加快，经济发展、人民生活水平的提高，环境建设日益重要。除城市林网及园林景观，草坪是城市面积最大的绿色生命之源。但是，草坪草由于存在耗水量大，不能耐受过冷或过热的气候，绿期较短等不足之处，限制了其更广泛的应用。基因转化可打破物种间基因交流的界限，将外源目的基因导入现有的草坪草品种中，获得具有更理想性状的新品种，为满足多种多样草坪草需求的新品种培育，提供了更广阔的技术平台。
选择、筛选转化的细胞和植株是基因转化的关键步骤之一。由于在质粒构建时已经人为地嵌合抗生素的标记基因，使其成为筛选植物转化细胞的显性遗传标记，所以实现基因转化的细胞或植株能够对某些抗生素表现抗性的标记性状。转化的细胞在附加一定浓度抗生素的选择培养基上生长、发育、分化而获得的再生植株可判断为转化植株。如果抗生素筛选临界浓度过高可能使转化植株致死，相反其浓度过低可能出现大量假阳性的转化植株，因此，抗生素筛选临界浓度在此就尤为重要。
自从1994年在水稻上证实农杆菌技术在单子叶植物中可以运用以来，草坪草的农杆菌转化研究也获得了成功。但农杆菌介导的草坪草遗传转化存在转化率低的问题，而且，就草坪草的抗生素筛选临界浓度的确定方法未见报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种简单方便，准确率高的草坪草转化子抗生素筛选临界浓度的确定方法。
本发明包括以下步骤
1)以相应草坪草成熟胚为外植体接种于愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织；所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)待愈伤组织长到直径为2~5mm时，将其转移到继代培养基上进行继代培养，所述继代培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)取同一培养时期，直径相同的愈伤组织A分置于含不同浓度抗生素筛选剂的培养基上，记录每一处理愈伤组织的重量(W0)；4)培养一段时间后，再次记录其重量(Wt)；5)计算愈伤组织的重量增长率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈伤组织的相对质量增长率R＝r/r0×100％，r0为不加筛选剂培养的愈伤组织重量增长率；6)以愈伤组织的相对质量增长率R为指标，当R≤1％，则此抗生素浓度达到筛选临界浓度。
所述成熟胚经70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗3~4次，晾干后接种在诱导培养基上。
所述愈伤组织诱导培养基的2，4-D浓度为2-8mg/l为较佳。
所述愈伤组织诱导培养基中还含有浓度为300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有浓度为25g/l的甘露糖，以使愈伤组织的状态良好，有利于长时间的筛选。
同一培养时期指的是经继代培养后，相同状态的色泽鲜黄，直径4-5mm大小胚性愈伤组织。
所述抗生素筛选剂为G418(庆大霉素衍生物，Geneticin)或Kan(卡那霉素，kanamycin)或Hyg(潮霉素，Hygromycin)或Bastar(除草剂phosphinothricin的合成品)。
针对农杆菌介导的遗传转化中存在的问题，本发明包含以下内容1.将成熟种子经70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗3至4次，凉干后接种在诱导培养基上。诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D。
2.待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，及时将其转移到继代培养基上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜培养基，当愈伤组织形成大量胚性愈伤组织后，即可用作转化受体。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在26℃左右。
3.取愈伤组织直径大小相同的胚性愈伤组织，置于含不同浓度梯度的抗生素筛选剂的培养基上，记录每一处理愈伤组织的质量(W0)，同时设置对照(培养基中不加抗生素筛选剂)。
4.培养一段时间后，再次记录其质量(Wt)，愈伤组织的质量增长率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈伤组织的相对质量增长率R＝r/r0×100％(r0为对照培养的愈伤组织质量增长率)。
5.以愈伤组织的相对质量增长率R为指标，当R≤1％，则表明在含某一剂量抗生素的培养基上培养的愈伤组织质量增长趋于停滞，增长速率趋近于0，而在对照(抗生素含量为0mg/L)培养基上培养的愈伤组织质量仍持续增长，因此可以认为在这一剂量抗生素的培养基上培养的愈伤组织质量增长趋于停滞的原因是由于抗生素浓度达到筛选临界浓度，限制了愈伤组织的增殖。
发明人研究发现在上述过程中用到的水解酪蛋白的浓度为300mg/l；脯氨酸的浓度为500mg/l；甘露糖的浓度为25g/l为最佳用量。2，4-D的浓度为2至8mg/l对愈伤组织均有良好地诱导效果。以上浓度均有利于愈伤组织作长时间的筛选。
胚性愈伤组织需在良好的状态下才能被抗生素长时间地筛选，农杆菌转化浸染的过程会对愈伤组织的细胞造成一定程度的损伤，如果马上对其进行筛选，会造成愈伤组织(其中包括转化子)大量死亡。而由本发明所确定的筛选用的临界浓度的抗生素便可发挥作用。在农杆菌与胚性愈伤组织共培养后，需进行较长时间的愈伤组织恢复培养，采用一步筛选法，即将转化子直接接种于含有一定浓度抗生素(可以是添加300mg/l的头孢霉素)的培养基上进行培养。恢复培养是培养基中不添加筛选用的抗生素，仅添加300mg/l的头孢霉素用以抑制农杆菌的生长，以减少农杆菌对细胞的伤害。而在后继的筛选培养基上除了需一直添加300mg/l的头孢霉素外，还要添加由本发明的方法所确定的临界浓度的抗生素。
图1示愈伤组织的诱导图2示愈伤组织的继代图3示愈伤组织的分化(此图为转化目的基因的愈伤组织通过本方法筛选之后能够存活，而且仍具有分化能力，得到分化芽；而没有转化目的基因的愈伤组织通过本方法筛选之后褐化致死)。
图4示再生植株的生根(此图为转化目的基因的分化芽通过本方法筛选之后仍能生根得到转化的再生植株，而得到转化的再生植株是遗传转化的最终目的)图5示G418筛选临界浓度的确定(mg/L)图6示Hyg筛选临界浓度的确定(mg/L)图7示kan筛选临界浓度的确定(mg/L)具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1、草地早熟禾转化子的抗生素筛选临界浓度的确定方法(1)将草地早熟禾优异、巴林、肯塔基三个品种成熟种子经70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗3至4次，凉干后接种在诱导培养基上。诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白300mg/l、脯氨酸500mg/l和2，4-D4mg/l。
(2)待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，将其转移到继代培养基(与诱导培养基相同)上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜培养基，当愈伤组织形成大量胚性愈伤组织后，即可用作转化受体。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在26℃左右。
(3)取同一培养时期，愈伤组织直径大小相同的胚性愈伤组织，置于含不同浓度梯度的抗生素筛选剂的培养基上。其中潮霉素(hygromycin，Hyg)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六个浓度梯度；G418(庆大霉素衍生物)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六个浓度梯度；Kan(卡那霉素)分0，200mg/L，400mg/L，600mg/L，800mg/L，1000mg/L六个浓度梯度。每浓度梯度设置五个重复，即倒五个平板，每个平板上(培养皿)接种21颗愈伤组织，记录每一平板上愈伤组织的质量(W0)。
则潮霉素的6个浓度梯度的W0平均值分别为3.1833g，6.4633g，2.6g，1.2267g，0.62g，0.575g；G418的6个浓度梯度的W0平均值分别为3.1833g，0.6663g，0.5851g，0.5560g，0.3321g，0.315g；Kan的6个浓度梯度的W0平均值分别为3.1833g，2.3533g，3.2533g，1.3367g，1.5167g，0.9733g。
(4)培养相同的一段时间后，再次记录各平板上愈伤组织质量(Wt)，则潮霉素的6个浓度梯度的Wt平均值分别为8.8067g，9.62g，3.6233g，1.82g，0.8967g，0.89g；G418的6个浓度梯度的Wt平均值分别为8.8067g，0.8584g，0.8586g，0.597g，0.363g，0.3023g；Kan的6个浓度梯度的Wt平均值分别为8.8067g，4.94g，6.12g，2.4433g，2.5233g，1.33g。
愈伤组织的质量增长率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈伤组织的相对质量增长率R＝r/r0×100％(r0为对照即在筛选剂含量为0mg/L的培养基上培养的愈伤组织质量增长率)。具体计算实例以G418浓度为50mg/L计算为例，愈伤组织的质量增长率r＝0.3023-0.315/0.315×100％＝-4.03％，而G418浓度为40mg/L时r为9.30％；对照愈伤组织质量增长率r0＝176.65％；愈伤组织在50 mg/L的相对质量增长率R＝r/r0×100％＝-2.28％，在40mg/L的相对质量增长率R＝5.15％。显然，在培养同一段时间后，抗生素G418的临界浓度为50 mg/L。其它抗生素不同浓度的R值见表1。
结果表明这三种筛选剂对草地早熟禾愈伤组织的生长有不同的抑制作用，其中以G418的抑制效果最为明显，在较低的使用浓度下就可以使愈伤组织的增长率大幅度下降，Hyg的抑制效果次之，而Kan的抑制效果最差，当其浓度达到500mg/L时，草地早熟禾愈伤组织仍有24.69％的增长能力。因此，在草地早熟禾的转化中可以应用G418 50mg/L这种筛选剂浓度来进行转化子的筛选。
表1不同抗生素浓度对愈伤组织生长的抑制作用Table 1 Effects of different antibiotics for cailus’growth
实施例2、匍匐翦股颖转化子的抗生素筛选临界浓度的确定方法(1)将匍匐翦股颖L-93、回旋、潘娜A-1三个品种成熟种子经70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗3至4次，凉干后接种在诱导培养基上。诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白300mg/l、脯氨酸500mg/l和2，4-D 4mg/l。
(2)待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，将其转移到继代培养基(与诱导培养基相同)上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜培养基，当愈伤组织形成大量胚性愈伤组织后，即可用作转化受体。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在26℃左右。
(3)取愈伤组织直径大小相同的胚性愈伤组织，置于含不同浓度梯度的抗生素筛选剂的培养基上。其中潮霉素(hygromycin，Hyg)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六个浓度梯度；G418(庆大霉素衍生物)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六个浓度梯度；Kan(卡那霉素)分0，100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L六个浓度梯度。每浓度梯度设置五个重复，即倒五个平板，每个平板上(培养皿)接种21颗愈伤组织，记录每一平板上所有愈伤组织的总质量(W0)。则潮霉素的6个浓度梯度的W0平均值分别为4.9867g，3.9319g，2.9732g，1.9225g，2.8598g，1.507g；G418的6个浓度梯度的W0平均值分别为4.9867g，0.5640g，0.418g，0.4893g，0.3321g，0.315g；Kan的6个浓度梯度的W0平均值分别为4.9867g，2.6207g，1.9171g，2.2590g，2.4764g，2.4895g。
(4)培养相同的一段时间后，再次记录愈伤组织总质量(Wt)，则潮霉素的6个浓度梯度的W0平均值分别为8.4733g，9.2867g，5.29g，2.82g，4.0233g，2.3g；G418的6个浓度梯度的W0平均值分别为8.4733g，1.7036g，0.0.8184g，0.597g，0.383g，0.3023g；Kan的6个浓度梯度的W0平均值分别为8.4733g，2.3621g，1.9171g，2.2496g，2.4764g，2.4895g。
愈伤组织的重量增长率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈伤组织的相对质量增长率R＝r/r0×100％(r0为对照培养的愈伤组织重量增长率)。
结果表明这3种筛选剂对匍匐翦股颖愈伤组织的生长有不同的抑制作用，其中以G418的抑制效果最为明显，在较低的使用浓度下就可以使愈伤组织的增长率大幅度下降，Hyg的抑制效果和Kan的抑制效果较差(表2)。因此，在匍匐翦股颖的转化中可以应用G418这种筛选剂来进行转化子的筛选，当筛选浓度为40mg/L时，便可达到筛选目的。
表2不同抗生素浓度对愈伤组织生长的抑制作用Table2 Effects of different antibiotics for callus’growth
权利要求
1.草坪草转化子抗生素临界浓度筛选方法，该方法包括以下步骤1)以相应草坪草成熟胚为外植体接种于愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织；所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)待愈伤组织长到直径为2～5mm时，将其转移到继代培养基上进行继代培养，所述继代培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)取同一培养时期，直径相同的愈伤组织A分置于含不同浓度抗生素筛选剂的培养基上，记录每一处理愈伤组织的重量W0；4)培养一段时间后，再次记录其重量Wt；5)计算愈伤组织的重量增长率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈伤组织的相对质量增长率R＝r/r0×100％，r0为不加筛选剂培养的愈伤组织重量增长率；6)以愈伤组织的相对质量增长率R为指标，当R≤1％，则此抗生素浓度达到筛选临界浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述成熟胚经70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗3～4次，晾干后接种在诱导培养基上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基的2，4-D浓度为2-8mg/l。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基中还含有浓度为300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有浓度为25g/l的甘露糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于同一培养时期相同状态的愈伤组织为色泽鲜黄，直径4-5mm大小。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素筛选剂为庆大霉素衍生物或卡那霉素或潮霉素或除草剂phosphinothricin的合成品。
全文摘要
本发明公开了一种草坪草转化子的抗生素筛选临界浓度的确定方法，该方法包括以下步骤1)以成熟胚为外植体诱导愈伤组织；2)取愈伤组织置于含不同浓度抗生素筛选剂的培养基上，记录每一处理愈伤组织的重量(W
文档编号A01H4/00GK101015273SQ20071003448
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月27日 优先权日2007年2月27日
发明者易自力, 陈智勇, 蒋建雄, 覃静萍, 蔡能, 唐小艳 申请人:湖南农业大学, 易自力