专利名称：马尾藻原生质体的分离和再生的制作方法
技术领域：
本发明涉及马尾藻的繁育，具体地说是马尾藻原生质体的分离和再生。
背景技术：
马尾藻(&rgo^MW spp)属的种类，如海蒿子CS.pa肌^m)、海黍子(51. w她.c謹)、鼠尾藻(6*. f/w"6^"g77)、 匍枝马尾藻(51./ 一qyM謂)等是我国的 重要经济海藻，通常被用作饲料、藻胶和医药工业的原料，也可用作海藻 肥料、饲料添加剂等；马尾藻因其巨大生物量和广泛的分布， 一直是维持 我国海域生态平衡最主要的大型藻类之一。近几年来，随着人们对马尾藻 应用研究的不断深入，愈来愈多的人认识到马尾藻的经济价值和生态效益， 企业对马尾藻的需求逐年增加，环境的日益恶化也要求恢复原有的马尾藻 植被环境。然而，由于受到近海采捕、港口建设、藻类/鱼类/贝类采集与养 殖等因素的影响，马尾藻的自然资源量在不断的下降，从而造成马尾藻的 供需矛盾不断加剧，近海环境日益恶化。因此，开展马尾藻的人工养殖与 植被恢复已成为众所关注的迫在眉睫的问题。
对其基础生物学的研究是顺利进行马尾藻的人工养殖与植被恢复的前 提，成熟的育苗方式，好的马尾藻品种(品系)是成功进行马尾藻增养殖 的必要条件。植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的"裸露细胞"， 是开展基础研究的理想材料。植物原生质体再生技术在理论和实践上都有 很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它不仅 是一种规模化育苗的方式，也能克服远缘杂交有性不亲和障碍，并且可克 眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因 导入栽培种中，原生质体再生与融合技术可望成为植物改良的有力工具之 一。因此，发展马尾藻单细胞克隆技术具有非常重要的意义。
藻类是相对低等的植物，在单细胞克隆技术方面要比动物容易一些， 然而马尾藻原生质提的获得一直是个难题。酶解法分离原生质体是一个常 用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成， 因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
发明内容
本发明在前人于其他植物研究的基础上，添加了海螺酶，采用同时使 用纤维素酶、海螺酶和果胶酶去除马尾藻的细胞壁，成功克服了原生质体 得率低得问题，首次获得大量用于再生的马尾藻原生质体，并成功的获得 大量的原生质体再生个体。马尾藻体细胞原生质体再生技术的建立，可以 在短期内可以大量产生适合养殖的幼苗，为马尾藻的增养殖的实施奠定了 基础，同时也为原生质体化学、激光诱变、物理诱变育种以及原生质体融合培育新品种提供了技术上的支持。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
马尾藻原生质体的分离和再生，以含有重量浓度0.9-1.1 %纤维素酶、
0.9-1.1 %果胶酶、0.7-0.9mol/L海螺酶的灭菌人工海水配制的酶液、18 22°C、黑暗条件下，酶解5 7h马尾藻样品，离心获取原生质体；按常规 方法，将原生质体铺于富营养海水中培养成新藻苗。 具有如下步骤，
(一) 原生质体的分离
1) 取马尾藻分支的嫩叶，切片后，用酶液浸没，置于摇床上在18 22°C 黑暗条件下，酶解5 7h，用200目网过滤除去未完全消化的残渣；
酶液的配制以灭菌人工海水为溶剂，其中含有重量浓度0.9-1.1 %纤 维素酶、0.9-1.1 %果胶酶、0.7-0.9mol/L海螺酶；
2) 350-550r/min离心3 5min，收集原生质体；
3) 在800-1000rpm条件下离心4 6分钟，弃上清，收集沉淀；
4) 取沉淀0.2-0.6ml加入3 4ml质量浓度13% CPW洗液， 800-1000rpm离心2-5分钟，留lml洗液，弃除其余上清液；
5) 用滴管将上述混有原生质体的洗液吸净，轻轻滴于3-5ml质量浓度 20%蔗糖溶液上，在800-1000rpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离 心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与10。％ CPW之 间，破碎的细胞残渣沉入管底；
6) 用移液器轻轻将状态好的原生质体吸出，力Q3-4mll3X CPW洗液， 800-1000rpm离心2-5分钟，弃上清，收集原生质体沉淀；
(二) 原生质体的培养
按常规方法，按l: 25-40的体积比将原生质体铺于富营养海水中进行 浅层培养，在温度18 22°C，光照度18 22 pmol/m/s，光照10-12h/d的 条件下培养，经2个周后在培养基上出现肉眼可见的褐色的萌发的新藻苗。
人工海水的组成100 mL蒸馏水中含有2.63 gNaCl， 0.609 gMgCl， 0.193gMgSO， 0.074gKCl， O.llgCaCl， O.lgTris， pH8.3;人工海水配 置后在0.1-0.15MPa下灭菌25-30分钟；
13 %CPW洗液组成27.2mg/L KH2P04, 101.0 mg/ L KN03, 1480.0 mg/L CaCI2.2H20, 246.0 mg/ L MgS04, 0.16mg/ L KI, 0.025mg/L CuS04, 13%(W/V) 甘露醇，以消毒海水为溶剂。
所述20%蔗糖溶液是以消毒海水为溶剂配制的；所述富营养海水为
BG-1^海水化营养液。一
采集马尾藻样品后采用质量浓度0.1% HgCl2表面消毒8 10min后，在 消毒海水中温度19-21°C，光照度18-22 )imol/m/s，光照10-12/d的条件下 充气暂养，消毒海水每天更换一次。
本发明具有如下优点
5(1)本发明克服了马尾藻体细胞克隆再生的原生质体获得率低的问 题，使得马尾藻叶片原生质体的获得率最高达到40%。
(2) 原生质体培养再生所用时间短。实验结果显示，BG-ll海水化营养 液对原生质体的生长有明显的促进作用，萌发率和生长量分别是未加BG-ll 的128.54%禾n 137.29%。棕绳附着试验显示，要达到夹苗所用长度，只要 将萌发的藻株培养4个周即可，而且夹苗培养后，新生植株的适应能力和 生长速度与野生萌芽植株没有明显差异。
(3) 原生质体培养费用低廉。在培养前期，对无菌操作要求无需很严格， 而一周后可以改用煮沸的海水甚至是天然的过滤海水。另外，培养基费用 低廉。
(4) 原生质体再生成活率高，培养的原生质体成活率在15—23%之间， 相对于大量的细胞而言，这个数字是惊人的。萌发后的原生质体片段的成 活率高于80%。
(5) 对马尾藻的育种意义重大。为原生质体化学、激光诱变、物理诱变 育种以及原生质体融合培育新品种提供了技术上的支持。
(6) 是马尾藻人工育苗的一种重要方式。马尾藻产生卵子和精子，在一 定程度上具有高等植物的属性，因此大规模有性育苗可能需要较高的技术。 因此，本发明对马尾藻人工育苗提供了很好的研究基础。
(7) 是马尾藻种质保存的另一种形式。
图1为海蒿子(5*.体细胞原生质体的再生过程，其中，A: 酶处理后6小时；B:酶处理后l周；C:酶处理后4周；D:酶处理后30
天。标尺，50,。
具体实施方式
实施例
1、 酶液的准备
配制含有质量浓度1%纤维素酶、质量浓度1%果胶酶，0.8mol/L海螺 酶的酶液，以人工海水(100 mL蒸馏水中含有2.63gNaCl， 0.609 gMgCl， 0.193 gMgSO， 0.074 gKCl， O.llgCaCl， 0.1 g Tris (pH 8.3))为溶剂，以上 酶液为处理终浓度，人工海水配置后在高压(0.12-0.14MPa)灭菌28分钟。
2、 样品的采集与处理
试验材料海蒿子(X;^//WMm)的分枝叶片的体细胞试验材料采自山 东荣j^桑沟湾，样品采集时间为2006年5月16号。样品采集后进行暂养。
采集海边马尾藻属的海蒿子(5:;^//WMm)，精选色泽亮丽、完整的藻株， 用0.P/。HgC12表面消毒10min后，在消毒的天然海水中(煮沸)室内暂养 一个周(温度20士rC，光照度 20 pmol/m/s，光照12/d的条件下充气暂 养)。暂养液每24小时更换一次。
3、 原生质体的分离
6取马尾藻分支的嫩叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上(70rpm)， 在18 22^黑暗条件下，酶解6h，用200目网过滤除去未完全消化的残 渣，然后离心(500r/min， 4min)收集原生质体。
在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清，收集沉淀。取沉淀0.4ml加 入4ml 13 % CPW洗液(27.2mg/L KH2P04, 101.0 mg/ L認03, 1480.0 mg/L CaCI2.2H20, 246.0 mg/ L MgS04, 0.16mg/ L KI, 0.025mg/L CuS04， 13%(W/V) 甘露醇，以消毒海水为溶剂)，相同条件下离心5分钟，弃上清，留lml洗 液。用滴管将混有原生质体的lml洗液吸净，轻轻滴于20X蔗糖溶液上(5ml 离心管装3ml20X蔗糖溶液，以消毒海水为溶剂)，在1000rpm条件下离心 IO分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20 %的蔗糖与10% CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。
用200|il移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入 下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中.加4ml 13% CPW洗液(以 消毒海水为溶剂)，1000rpm离心5分钟，弃上清，用血球计数板调整原生 质体密度为80个/ml左右。
4、原生质体的培养
将原生质体铺于富营养海水(BG-11海水化营养液)中进行浅层培养， 在温度18 22。C，光照度 20±2 (amol/m/s，光照12h/d的条件下培养，经2 个周后在培养基上出现肉眼可见的褐色的萌发的新藻苗。
BG-ll配方以人工海水为溶齐U，其中含有H3B03 2.86吗/l，MnC1.4H20
1.81|ig/l， ZnS04.7H20 0.222吗/1， NaMo04.2H20 0.39吗/1， CuS04.5H20 0.079pg/l， Co(N03)2.6H20 0.0494|ag/l;
实验结果马尾藻叶片原生质体的获得率为17%左右，因此可以获得
大量的完整的细胞原生质体。组织培养经2个周后在培养基上出现肉眼可 见的褐色的萌发的新藻苗，用于培养的原生质体的成活率为18.37%。
试验结果表明经过酶(纤维素酶、海螺酶和果胶酶)处理后获得的原
生质体可以在无菌条件下再生发育成为新的个体，成活率为14.39 — 18.55 %之间。这个试验的成功，为体细胞克隆法苗种繁育、原生质体诱变以及 原生质体间的融合育种奠定基础。
权利要求
1. 马尾藻原生质体的分离和再生，其特征在于以含有重量浓度0.9-1.1％纤维素酶、0.9-1.1％果胶酶、0.7-0.9mol/L海螺酶的灭菌人工海水配制的酶液、18～22℃、黑暗条件下，酶解5～7h马尾藻样品，离心获取原生质体；按常规方法，将原生质体铺于富营养海水中培养成新藻苗。
2. 马尾藻原生质体的分离和再生，具有如下步骤，(一) 原生质体的分离1) 取马尾藻分支的嫩叶，切片后，用酶液浸没，置于摇床上在18 22°C 黑暗条件下，酶解5 7h，用200目网过滤除去未完全消化的残渣；酶液的配制以灭菌人工海水为溶剂，其中含有重量浓度0.9-1.1 %纤 维素酶、0.9-1.1 %果胶酶、0.7-0.9mol/L海螺酶；2) 350-550r/min离心3 5min，收集原生质体；3) 在800-1000rpm条件下离心4 6分钟，弃上清，收集沉淀；4) 取沉淀0.2-0.6ml加入3 4ml质量浓度13% CPW洗液， 800-1000rpm离心2-5分钟，留lml洗液，弃除其余上清液；5) 用滴管将上述混有原生质体的洗液吸净，轻轻滴于3-5ml质量浓度 20%蔗糖溶液上，在800-1000rpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离 心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与10% CPW之 间，破碎的细胞残渣沉入管底；6) 用移液器轻轻将状态好的原生质体吸出，加3-4mll3X CPW洗液， 800-1000rpm离心2-5分钟，弃上清，收集原生质体沉淀；(二) 原生质体的培养按常规方法，按l: 25-40的体积比将原生质体铺于富营养海水中进行 浅层培养，在温度18 22°C，光照度18 22 pmol/m/s，光照10-12h/d的 条件下培养，经2个周后在培养基上出现肉眼可见的褐色的萌发的新藻苗。
3. 按照权利要求2所述马尾藻原生质体的分离和再生，其特征在于 人工海水的组成100 mL蒸馏水中含有2.63 gNaCl， 0.609gMgCl， 0.193 gMgSO， 0.074gKCl， O.llgCaCl， O.lgTris， pH8.3;人工海水配置后在 0.1-0.15MPa下灭菌25-30分钟；13%CPW洗液组成:27.2mg/L KH2P04, 101.0 mg/ L KN03, 1480.0 mg/L CaCI2.2H20, 246.0 mg/ L MgS04, 0.16mg/ L KI, 0.025mg/L CuS04, 13%(W/V) 甘露醇，以消毒海水为溶剂。
4.按照权利要求2所述马尾藻原生质体的分离和再生，其特征在于 所述20%蔗糖溶液是以消毒海水为溶剂配制的；所述富营养海水为BG-ll 海水化营养液。
5.按照权利要求1一或2所述马尾藻原生质体的分离和再生，其特征在 于采集马尾藻样品后采用质量浓度0.1。/oHgCl2表面消毒8 10min后，在 消毒海水中温度19-21°C，光照度18-22 (miol/m/s，光照10-12/d的条件下 充气暂养，消毒海水每天更换一次。
全文摘要
本发明涉及马尾藻的繁育，具体地说是马尾藻原生质体的分离和再生，以含有重量浓度0.9-1.1％纤维素酶、0.9-1.1％果胶酶、0.7-0.9mol/L海螺酶的灭菌人工海水配制的酶液、18～22℃、黑暗条件下，酶解5～7h马尾藻样品，离心获取原生质体；按常规方法，将原生质体铺于富营养海水中培养成新藻苗。本发明在前人于其他植物研究的基础上，添加了海螺酶，采用同时使用纤维素酶、海螺酶和果胶酶去除马尾藻的细胞壁，成功克服了原生质体得率低得问题，首次获得大量用于再生的马尾藻原生质体，并成功的获得大量的原生质体再生个体。
文档编号A01G33/00GK101422128SQ200710113580
公开日2009年5月6日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者叶乃好, 李晓川, 王清印 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所