专利名称：仙客来组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的快速繁殖方法，尤其涉及仙客来组织培养快速繁殖 方法，属于植物生物技术领域。
背景技术：
仙客来(Cyclamen pera/cw附M/// )是报春花科Primulaceae属的一个种， 是欧洲和日本及中国北方一个有悠久历史的著名的盆栽花卉。因其颜色艳丽、
花形独特、品种丰富，盛开于元旦、春节等节日深受人们的喜爱，国际和国内 市场的需求日益增多。我国大约在20-30年代引入仙客来，50年代初在北京、 天津、青岛等地进行了栽培技术和育种的研究，80年代又从美国、日本等地引 进了一些新品种，最近几年，欧洲的品种也开始引入我国，国内集中形成了一 定的商品性规模，由于引种历史和气候条件等原因，仙客来更是北京、天津、 河北和山东省具有优势、产业化开发程度较高的栽培花卉之一，年产量可达上 千万盆，己成为农村经济增长的一个重要产业之一。但是，仙客来种苗生产的 关键技术一直是制约我国仙客来生产发展和经济效益的重要因素之一。因为， 仙客来一直是以种子进行繁殖，花农在制种过程中连年自交、近亲繁殖，造成 了我国原有品种严重退化；对新引入和选育的优良品种，后代种苗的性状又严 重分离，不能保持种系的纯化，一 特别是观赏价值越高的品种其优良性状的固定 越困难，目前，我国又未有先进的育种技术与之相配套，仙客来优良品种的Fi 代种子只能靠进口，价格很昂贵，这成为制约仙客来经济效益，花农收益低的 主要因素。
利用组织培养的方法建立优系仙客来的无性繁殖体系，进行种苗的工厂化
育苗生产，具有恢复和保持种性、固定优良性状、保证苗木的整齐性，快速大 量繁殖优系品种的优势，可以解决仙客来生产上的种苗质量问题。
利用生物技术、组织培养的方法进行种苗生产，在其它许多花丼上(如兰花、 菊花、西洋鹃、凤梨科植物、玫瑰、康乃馨以及安祖花等等)早已成为工厂化的 商品生产，并为许多国家和我国许多公司带来了丰厚的经济效益。而仙客来作 为一种球茎类植物，在组织培养再生器官发生过程中表现出了独特的性质，有一
定的难度。从二十世纪50年代开始即有仙客来组织培养的报道，主要是美国和 曰本的科学家在实验室的一些试验。从50年代到80年代一些试验表明，利 用仙客来的块茎、叶片和叶柄均能够产生出愈伤组织、茎芽、类似块茎和根的 结构。仙客来是北欧地区最受欢迎的室内植物之一，从90年代开始，比利时、 德国、丹麦和挪威等国家的科学家也在做这方面的工作，为了提高抗病性，增 加香味和培育在夏天仍能开花的仙客来，德国的蔬菜观赏植物所(IVOC)正在对 杂交后代的种苗进行无性繁殖方法固定其性状；比利时的科学家Willy Dilleii ^ /(1996)， 1996年第一次比较详细的报道了利用仙客来开花后成苗叶片的组培 增殖中，适宜愈伤类型的选择过程，并获得了一定数量的再生植株并生长开花； 1999年约旦的科学家对野生仙客来进行了以保存利用野生种质资源为目的的组 织培养的研究。日本的和田.薰、柴田.道夫和村琦.公明分别在《农耕与园艺》上 对日本的仙客来组织培养产业育苗研究现状和展望进行了全面的论述，真正从 产业育苗的角度探索组织培养育苗的可能性，日本从80年代开始投入了一定的 力量进行了研究和开发，做了大量的工作，在培养的取材部位、灭菌方法等取 得了明显的进展，并利用黄花叶柄和球茎等部位产出了组培苗。但是，在生根、 驯化等过程中的关键技术上尚未解决， 一直到2000年日本开始有产业化育苗成 功的报道，目前的研究趋势是朝向大量繁殖中的一些限制性技术，包括变异问 题和集中上市问题等进行全面的突破，由于日本在仙客来正规育种上是国际领 先地位，因此，他们对这一问题的解决没有我们这么迫切。我国的仙客来组织 培养研究从80年代开始有人在做，傅新生等在85年最早有一篇简报，侯喜林
等在1991年、张方等在1992年分别报道过利用仙客来黄花叶柄和离体叶片培 养成试管苗，2003年又有几篇报道出现，但是均为零散，不完整的初探性质的 试验，与产业化育苗的应用有很大的距离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种仙客来组织 培养快速繁殖方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的-一种仙客来的组织培养快速繁殖方法，包括
(1) 取已开花的仙客来新生叶片为外植体，将外植体消毒后接种到诱导培养 基上诱导产生愈伤组织；
(2) 将愈伤组织转接到分化培养基上培养，得到不定芽；筛选不定芽球作为 增殖器官，连续继代10次以上可稳定增殖，不定芽球转接到下述培养基中进行 生长培养1/2MS+6-苄基嘌呤(6-BA)0.2 mg/L+萘乙酸(NAA )0.02 mg/L，得到健 壮的无根试管苗；(说明MS培养基刘庆昌，吴国良主编的植物细胞培养技 术[M]，中国农业大学出版社，33);
(3) 将无根试管苗转接到下述生根培养基中培养1/2MS + NAA 0.5-1.5mg/L， 得到生根试管苗；
(4) 将生根试管苗炼苗后移栽到花盆或苗圃中，再按照常规方法进行栽培管理。
优选的步骤(l)取己开花的胜利女神、大红或粉红仙客来新生叶片为外植
体；
步骤(l)中所述的诱导培养基是1/2MS+激动素(KT) 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L+ 2,4-D 2mg/L;
步骤(2)中所述的分化培养基优选是1/2MS+ KT 0.2mg/L+ 6-BA 2mg/L。 步骤(4)中所采用的炼苗基质优选为草碳，其pH值为5.8-6;此外，该炼苗
基质中还可含有少量的珍珠岩。
本发明的一个优选的具体技术方案如下
以仙客来胜利女神、大红和粉红的新生叶片为外植体，消毒后初培养于下
述培养基上1/2MS+ KT 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L+ 2,4-D 2mg/L，诱导产生愈伤 组织(诱导率为100%);将愈伤组织转接到分化培养基(1/2]^8+ KT 0.2mg/L+ 6-BA2mg/L)上培养，获得70%-80%的不定芽分化率；筛选不定芽球为增殖器官， 连续继代10次可获得2-3倍的稳定增殖倍数，且变异率低于5%以下；试管苗生 根前经一代生长可以促进芽球生长成健壮的新梢，生长最佳培养基为1/2MS +6-BA0.2 mg/L +NAA0.02 mg/L;生长健壮的无根试管苗进行的生根试验结果表 明1/2MS+0.5-1.5mg/LNAA含量均可以诱导生根，生根率可达100%，平均单 株主根生根条数为4条，侧根发生也比较好。
选择合适的炼苗基质是炼苗成功的关键，基质配比是否合适对炼苗生长 影响很大，基质选择不合适会使幼苗停止生长或生长发育不良。进口草碳由于 纤维粗糙、孔隙度好，具有良好的通水透气能力，因此非常适合仙客来栽培。 同时，进口草炭已将pH值调至5.8-6，拆包即可使用，不需另外调整。另外， 增加小部分珍珠岩可以减少进口草炭的用量，对仙客来炼苗没有显著影响。
本发明方法繁殖的组培苗栽培至12月进入花期时，随机抽取同等栽培条 件下的实生苗和本发明方法繁殖的组培苗各30株，分别统计叶数、叶径、冠径 等性状指标进行比较发现，实生苗平均叶数为22.3枚，组培苗为35枚；实生苗平 均叶径为6.8厘米，组培苗为4厘米；实生苗平均冠径为20.7厘米，组培苗平均冠 径为18.6厘米。组培苗叶数显著多于实生苗，而实生苗叶径及冠径略大于组培苗。 从植株观赏性状来看，组培苗叶数多、叶片覆盖度好、植株紧凑、开花数多、 整齐一致，有更好的观赏性状。
图1 仙客来叶片愈伤组织形成。
图2仙客来叶片愈伤组织形成。
图3仙客来叶片愈伤组织上不定芽的形成。
图4仙客来叶片愈伤组织上不定芽的形成。
图5仙客来试管苗的生长。
图6仙客来试管苗的生长。
图7仙客来试管苗的生根。
图8仙客来试管苗的生根。
图9成活的仙客来试管苗。
图10开花的仙客来试管苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何 限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对 本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发 明的保护范围内。
实施例1
以仙客来的胜利女神的新生叶片为外植体，按照常规方法消毒后初培养于
下述培养基上1/2MS+ KT 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L+ 2，4-D 2mg/L，诱导产生愈 伤组织(诱导率为100%);将愈伤组织转接到分化培养基(分化培养基1/2MS+KT 0.2mg/L+6-BA2mg/L)上培养，获得70%-80%的不定芽分化率；筛选不定芽球为 增殖器官，连续继代10次以上均可获得2-3倍的稳定增殖倍数，且变异率低于 5%以下；试管苗生根前经一代生长可以促进芽球生长成健壮的新梢，生长最佳 培养基为MS+6-BA0.2 mg/L +NAA0.02 mg/L;将得到的健壮的无根试管苗进行 的生根试验接种到下述生根培养上诱导生根1/2MS + NAA0.5mg/L，生根率可
达100%，平均单株主根生根条数为4条，侧根发生也比较好。 实施例2
以仙客来的大红品种的新生叶片为外植体，按照常规方法消毒后初培养于 下述培养基上1/2MS+ KT 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L+ 2,4-D 2mg/L，诱导产生愈 伤组织(诱导率为100%);将愈伤组织转接到分化培养基(分化培养基1/2MS+KT 0.2mg/L+6-BA2mg/L)上培养，获得70%-80%的不定芽分化率；筛选不定芽球为 增殖器官，连续继代10次以上均可获得2-3倍的稳定增殖倍数，且变异率低于 5%以下；试管苗生根前经一代生长可以促进芽球生长成健壮的新梢，生长最佳 培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L +NAA0.02 mg/L;将得到的健壮的无根试管苗进行 的生根试验接种到下述生根培养上诱导生根1/2MS + NAA1.5mg/L，生根率可 达100%，平均单株主根生根条数为6条，侧根发生也比较好。
实施例3
以仙客来的粉红品种的新生叶片为外植体，按照常规方法消毒后初培养于 下述培养基上1/2MS+KT0.2mg/L+NAA0.2mg/L+2，4-D2mg/L，诱导产生愈 伤组织(诱导率为100%);将愈伤组织转接到分化培养基(分化培养基1/2MS+KT 0.2mg/L+6-BA2mg/L)上培养，获得70%-80°/。的不定芽分化率；筛选不定芽球为 增殖器官，连续继代9次以上均可获得2-3倍的稳定增殖倍数，且变异率低于 5%以下；试管苗生根前经一代生长可以促进芽球生长成健壮的新梢，生长最佳 培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L;将得到的健壮的无根试管苗进行 的生根试验接种到下述生根培养上诱导生根1/2MS + NAA0.8mg/L，生根率可 达100%，平均单株主根生根条数为5条，侧根发生也比较好。
试验例1
将实施例l-3所获得的生根试管苗炼苗；炼苗基质主要由草炭组成，还可含有少量的珍珠岩，pH值为5.8-6;炼苗后移栽到花盆或苗圃中，再按照常规方法 进行栽培管理。栽培至12月进入花期时，随机抽取同等栽培条件下的仙客来实 生苗和本发明方法繁殖的仙客来组培苗各30株，分别统计叶数、叶径、冠径等 性状指标进行比较发现，仙客来实生苗平均叶数为22.3枚，组培苗为35枚；仙 客来实生苗平均叶径为6.8厘米，仙客来组培苗为4厘米；仙客来实生苗平均冠 径为20.7厘米，仙客来组培苗平均冠径为18.6厘米。
从上述结果可见，本发明方法所培育的仙客来组培苗叶数显著多于仙客来 实生苗，而实生苗叶径及冠径略大于组培苗。从植株观赏性状来看，本发明方 法所培育的组培苗叶数多、叶片覆盖度好、植株紧凑、开花数多、整齐一致， 有更好的观赏性状。
权利要求
1、仙客来(Cyclamen persicum Mill)的组织培养快速繁殖方法，包括(1)取已开花的仙客来新生叶片为外植体，将外植体消毒后接种到诱导培养基上诱导产生愈伤组织；(2)将步骤(1)所获得的愈伤组织转接到分化培养基上培养，得到不定芽；筛选不定芽球作为增殖器官，连续继代后转接到下述培养基中进行生长培养1/2MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L；得到无根试管苗；(3)将无根试管苗转接到下述生根培养基中培养1/2MS+NAA0.5-1.5mg/L；得到生根试管苗；(4)将生根试管苗炼苗后移栽到花盆或苗圃中，再按照常规方法进行栽培管理。
2、 按照权利要求1的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤(l)取己 开花的胜利女神、大红或粉红仙客来新生叶片为外植体。
3、 按照权利要求1的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(l)中所 述的诱导培养基是1/2MS+ KT 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L+ 2，4-D 2mg/L。
4、 按照权利要求1的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中所 述的分化培养基是1/2MS+KT0.2mg/L+BA2mg/L。
5、 按照权利要求1的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤(2)中所 述的连续继代的次数是10次。
6、 按照权利要求1的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤(4)中所 采用的炼苗基质主要由草碳组成，其pH值为5.8-6。
7、 按照权利要求6的组织培养快速繁殖方法，其特征在于所述的炼苗 基质还含有少量的珍珠岩。
全文摘要
本发明公开了一种仙客来组织培养快速繁殖方法，包括(1)取已开花的仙客来叶片为外植体接种到诱导培养基上诱导产生愈伤组织；(2)将愈伤组织转接到分化培养基上培养得到不定芽；筛选不定芽球作为增殖器官，连续继代后得到无根试管苗；(3)转接到生根培养基中培养得到生根试管苗；(4)炼苗后移栽到花盆或苗圃中，再按照常规方法进行栽培管理。与实生苗相比，本发明方法所获得的组培苗叶数多、叶片覆盖度好、植株紧凑、开花数多、整齐一致，有更好的观赏性状。另外。本发明方法可恢复和保持仙客来的种性，固定其优良性状，保证苗木的整齐性，具有快速大量繁殖优系品种的优势，可以解决仙客来生产上的种苗质量问题。
文档编号A01G31/00GK101112179SQ20071014625
公开日2008年1月30日 申请日期2007年8月30日 优先权日2007年8月30日
发明者曲复宁, 由翠荣, 龚雪琴 申请人:曲复宁;由翠荣