专利名称：诱导山苍子丛生芽的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导山苍子丛生芽的方法，具体涉及一种诱导木本芳香植物山苍子丛生芽的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
山苍子(Litseacubeba)为樟科木姜子属中诸多植物的统称，全世界有200余种，我国有72种、18个变种和3个变型，主要分布于长江以南。其别名有山鸡椒(浙江)、山苍树(广东)、赛樟树(福建)、香叶(湖南)、木姜子(广西)。通过蒸馏方法获得挥发性芳香油称山苍子油，是出口换汇的大宗精油。山苍子精油主要用于提取柠檬醛，含量达70％，是制造紫罗兰酮、甲基紫罗兰酮、乙位紫罗兰酮及甲种维生素的主要原料，用于配制食品香精、化妆品和皂用香精；因其可降解致癌物质黄曲霉素，而对防止粮食发生霉菌污染有奇特功效。山苍子核油可作飞机用的高级润滑油，亦可用于制皂，提炼甘油、月桂酸、正癸酸、十二稀酸等重要化工原料。山苍子全株均可入药，有祛风散寒、温肾健胃、消肿止痛的功效。山苍子的花、果、根皮极香，是调味佐料。
山苍子适应性广，耐瘠薄，截水围土性能好，可用来治理疏林地水土流失。在退耕还林、还草工程实施以来，人们迫切寻找既能够保生态平衡，又能获得近期收益的树种。山苍子是一种将生态、经济、社会效益高度统一的树种，因其具有很高的经济价值，人们为得到大量柠檬醛就大量砍伐山苍子植株，这不仅严重破坏了生态平衡，还对山苍子资源的继续利用造成极坏的影响。
由于山苍子多野生，人工栽培极少，传统栽培主要是种子繁殖，而种子发芽率低，且极易丧失发芽力而导致育苗失败，因此很难满足国内外市场对山苍子的需求。通过植物组织培养法来快速获得整齐一致的山苍子苗木用于生产无疑是一种有效的解决方法。
国内已有关于山苍子组织培养方面研究报道(马崇坚、胡嘉凯，山苍子不同外植体的组织培养[J].林业科技，2005，30(4)56-57)。现有的组织培养方法虽能获得较高的增殖系数，但存在得苗率低、移栽后成活率不稳定的问题。因此，需要探索研究一种既能保证一定增殖系数又能保证有效的芽苗数的诱导丛生芽培养方法，解决组织培养山苍子成苗率不稳定的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种诱导山苍子丛生芽的方法，既能保证一定增殖系数，又能保证较高的得苗率和移栽后稳定的成活率，使山苍子丛生芽得到快速繁殖。
为实现这一目的，本发明采用山苍子的含节茎段为外植体，灭菌时省去常规的用70～75％酒精浸泡材料的环节，减少其对材料的杀伤，采取在灭菌液中用软毛刷不断刷拭材料的方法控制污染，接种初期采用转换培养基和暗培养的方法控制材料的褐化，然后依次在经筛选的芽诱导培养基和增殖培养基中培养，增殖培养阶段中采用增殖培养基和诱导培养基交替使用的方法，使山苍子丛生芽能正常萌发生长并迅速进入增殖状态，获得的芽苗健壮而整齐。
本发明的方法具体包括如下步骤 1、外植体灭菌选取山苍子干基部幼嫩枝条，去除叶片，清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分钟，其间不断用软毛刷刷拭枝条，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取含节茎段作外植.体，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天将外植体转接到新的MS培养基上。
2、芽诱导将在MS培养基上不再褐化的外植体转入诱导培养基中，诱导培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培养温度为25±2℃，光照周期12～14h.d-1，光强度为1200～2000lux；诱导培养21天后，获得诱导芽。
3、芽增殖切取单个诱导芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到增殖培养基上，增殖培养基为MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0，培养25～30天，获得增殖芽。
4、将增殖芽重复步骤2、步骤3进行继代培养，获得健壮山苍子丛生芽。
本发明诱导山苍子丛生芽快速繁殖山苍子的方法与现有技术相比，具有实质性的进步 1、提高了繁殖效率山苍子传统栽培主要是种子繁殖，而种子发芽率低，且极易丧失发芽力，因此常导致育苗失败。本发明取山苍子含节的茎段，用组织培养法进行丛生芽诱导的快速繁殖方法，不受外界条件的影响，四季皆可进行，不仅节约育苗占地，降低生产成本，并且保存了母体的全部优良性状，遗传性状稳定。这种方法可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。
2、有效地控制了污染山苍子精油含量高，现有的用75％酒精消毒外植体的环节很容易杀伤材料，难以保证有效外植体的数量。本发明在消毒操作时取消了用75％酒精消毒外植体的环节，采用3％的H2O2和含1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液浸泡材料，其间不断用软毛刷刷拭枝条，不仅使消毒效果明显提高，污染率控制在8.5％以下，还保证了足够的有效外植体数量。
3、抑制了培养基和外植体褐化芳香植物产生精油等次生代谢物质，按现有将外植体直接接种到诱导培养基中培养的方法易造成材料和培养基褐化，而山苍子含精油量很高，又属于木本芳香植物，较其它芳香植物更容易引起材料和培养基的褐化。本发明选用山苍子含节的茎段为外植体，在接种后放入暗处培养，并于第二天将外植体转接到新的培养基上，至不褐化再转接到诱导培养上，有效地控制了外植体和培养基的褐化。
4、筛选出了有效的诱导培养和增殖培养的培养基配方，且交替使用与已有关于山苍子组织培养技术的不同处在于在诱导培养阶段加入GA，培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，其优点在于外植体芽萌发时间提前至少一周，且得到的芽苗整齐，其节间明显；在增殖培养阶段采用MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L pH 6.0的培养基，增殖后再用同样的方法将芽转入诱导培养基进行继代培养，如此交替培养，芽能迅速进入增殖状态，增殖系数在4倍左右，且获得的芽苗健壮而整齐。
具体实施例方式 以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1 取山苍子干基部幼嫩枝条，去除叶片，流水清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15分钟，取出立即转入含质量浓度为5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡20分钟，不断用软毛刷刷拭枝条，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取含节茎段作外植体，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天再将外植体转接到新的MS培养基上。
将在MS培养基上不再褐化的外植体转入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+GA2.0mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0的诱导培养基上，置于温度25±2℃、光照周期12h.d-1、光强度为1200 lux的培养箱里进行诱导培养。21天后，获得诱导芽。
切取单个诱导芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到增殖培养基上，增殖培养基为MS+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0，置于温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux的培养箱里进行增殖培养。
30天后选取增殖培养中健壮的芽，用同样的方法将芽转入诱导培养基进行继代培养，培养温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux；如此交替培养，增殖系数在4倍以上。
实施例2 取山苍子干基部幼嫩枝条，去除叶片，流水清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡20分钟，取出立即转入含质量浓度为5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10分钟，不断用软毛刷刷拭枝条，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取含节茎段接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天再转接到新的MS培养基上。
将在MS培养基上不再褐化的外植体转入MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA1.0mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0的培养基上，置于温度25±2℃、光照周期12h.d-1、光强度为1200lux的培养箱里进行诱导培养。21天后，获得诱导芽。
30天后切取诱导培养中单个芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0培养基上，置于温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux的培养箱里进行增殖培养。
30天后用同样的方法将芽转入诱导培养基进行继代培养，培养温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000 lux；如此交替培养，增殖系数在3.5倍左右且得到的芽苗健壮整齐。
实施例3 按照实施例1的方法，只是继代培养阶段的激素浓度降低。具体方法在增殖培养30天后切取芽的含节茎段接种到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+GA1.0mg/L琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0培养基上；30天后用同样的方法将芽转入MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.3mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L pH 6.0培养基进行继代培养，培养温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000 luX；如此交替培养，增殖系数在4倍以上，得到的芽苗健壮整齐。
权利要求
1.一种诱导山苍子丛生芽的方法，其特征在于包括如下步骤
1)外植体灭菌选取山苍子干基部幼嫩枝条，去除叶片，清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分钟，其间不断用软毛刷刷拭枝条，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取含节茎段作外植体，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天将外植体转接到新的MS培养基上；
2)芽诱导将在MS培养基上不再褐化的外植体转入诱导培养基中，诱导培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培养温度为25±2℃，光照周期12～14h.d-1，光强度为1200～2000lux；诱导培养21天后，获得诱导芽；
3)芽增殖切取单个诱导芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到增殖培养基上，增殖培养基为MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培养25～30天，获得增殖芽；
4)将增殖芽重复步骤2)、步骤3)进行继代培养，获得健壮山苍子丛生芽。
全文摘要
本发明涉及一种诱导山苍子丛生芽的方法，采用山苍子的含节茎段为外植体，采用3％的H2O2和含1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液浸泡并不断用软毛刷刷拭，以此来代替酒精消毒，高效灭菌的同时保证了足够的有效外植体数量；接种初期采用转换培养基和暗培养的方法控制材料的褐化；芽诱导培养阶段加入GA，增殖培养阶段选用增殖培养基和诱导培养基交替使用的方法，芽萌发时间提前，迅速进入增殖状态，得到的芽苗健壮整齐。采用本发明诱导繁殖山苍子，不受外界条件的影响，四季皆可进行，不仅节约育苗占地，降低生产成本，并且保存了母体的全部优良性状，遗传性状稳定。本发明可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。
文档编号A01H4/00GK101147469SQ20071017043
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者张艳玲, 雷 姚, 王维鹏, 张静懿, 远 高, 陆伟芳, 燕 陆, 昂 李 申请人:上海交通大学