中和针对因子ⅷ的c1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体的制作方法

专利名称：中和针对因子ⅷ的c1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体的制作方法
中和针对因子Vl I I的C1结构域的抑制性抗体的抑制活性
的抗独特型抗体现有技术和引言本发明涉及针对因子VIII抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述因子VIII抑 制性抗体结合因子VIII的Cl结构域，以及涉及产生这种单克隆抗独特型抗体的细胞系，涉 及这种单克隆抗独特型抗体作为药物的用途，以及更特别地，涉及其用于制造治疗血友病A 的药物的用途。血友病A是与染色体X的异常相关的遗传疾病，其在受影响的人中显示了自身不 能凝结。这种疾病是涉及凝结的蛋白质因子VIII (FVIII)蛋白的基因上突变的结果，其决 定了血液中因子VIII的完全缺乏，或者其部分不足。血友病A是影响血液凝固的最常见的功能不全在法国，5000人中1名男性是患 病的，其代表了患有血友病的患者的80 %。另一种类型的血友病，血友病B，影响患血友病 的20%的患者它起因于其他凝结因子，称为因子IX中的缺乏。血友病(A或B型)的当前的治疗包括静脉内施用缺乏的或缺失的凝结因 子。在法国，用于治疗血友病患者的因子VIII可以以分级和生物技术法国实验室 (Laboratoire Fran9&lS du Fractionnement et desBiotechnologies) (LFB)或国际药 物实验室提供的血液衍生的药物的形式，或以通过遗传工程方法制备的重组药物的形式 来获得。编码因子VIII的ADN已经被有效地分离并在哺乳动物细胞中表达(Wood等， Nature (1984) 312 330-337)，它的氨基酸序列从ADNc推导出。分泌的因子VIII (FVIII)是分子量300KDa(2332个氨基酸)的糖蛋白，在内部凝 结途径的活化中起到关键作用。无活性的FVIII由六个区域组成A1 (残基1-372)、A2(残 基 373-740)、B (残基 741-1648)、A3 (残基 1649-2019)、Cl (残基 2020-2172)和 C2 (残 基2173-2332)，从N-末端到C-末端。在被分泌之后，FVIII作用于von Willebrand因子 (vffF)，其保护FVI11对抗血浆蛋白酶。FVIII在被凝血酶裂解时从vWF上解离。这种裂解 引起了 B结构域的消除和异二聚体的形成。FVIII以这种形式在血浆中循环。这种异二聚 体由重链(A1、A2)和轻链(A3、C1、C2)组成。当FVIII注入到血友病患者中时，它与患者的血液循环中的vonWillebrand因子 结合。活化的因子VIII作为活化的因子IX的辅助因子起作用，加速因子X向活化的因子 X的转变。活化的因子X将凝血酶原转变成凝血酶。然后凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维 蛋白，发生凝结。因子VIII施用遭遇的主要问题是在患者中针对因子VIII的抗体的出现，称为“抑 制性抗体”。这些抗体中和了因子VIII的促凝血活性，其在注入时就失活了。因而，施用的 凝结因子在可以停止出血之前被破坏了，其导致严重的并发症，因而引起治疗失效。进一步 的，某些遗传学的非血友病患者可能发展出针对内源因子VIII的抑制物这称为获得性血 友病。研究显示了抗因子VIII免疫反应是多克隆IgG型的，主要属于IgG4和IgGl亚 类，更罕见地属于IgG2。IgG3亚类从不出现。轻链通常是Kappa型的。IgG4的过量呈递对于具有长期的建立的抑制物的血友病患者是更显著的。FVIII分子的C2和A2结构域是免 疫反应的有帮助的目标，尽管在某些情况下，检测到针对A3结构域的抗体。当血友病患者 的血浆穿过具有固定的FVIII的免疫吸附柱时，有可能纯化总抗FVIII抗体。回收的数量 通常高于 100 μ g/10mg 总 IgG(Gilles JG 等(1993)Blood ;82 :2452_2461)。已经开发了动 物模型来研究因子VIII的抑制物的形成；用人类重组因子VIII免疫的大鼠显示了多克隆 型的快速免疫反应(Jarvis 等，Thromb Haemost. 1996 Feb ；75 (2) :318_25)。抗因子 VIII 抗体干扰因子VIII的功能的机制有很多，包括干扰因子VIII的蛋白水解裂解、干扰因子 VIII与不同配体例如von Willebrand因子(vWF)、磷脂(PL)、因子IX、活化的因子X(FXa) 或APC (活化的蛋白C)的相互作用。容许减弱这种免疫反应的后果的几种治疗是可用的，治疗的实例例如，涉及去氨 加压素(desmopressin)，去氨加压素是刺激因子VIII的产生的合成激素，凝结促进剂，例 如凝血酶原复合物的浓缩物或活化的凝血酶原复合物的浓缩物，重组因子Vila，血浆取出 法和大量或中间数量的因子VIII的输注。尽管如此，这些方法是非常昂贵和低效力的。由于这种免疫多克隆反应的体内分析的复杂性，针对因子VIII的某些结构域的 单克隆抗体已经被某些科研小组分离。就此，已经分离了 IgG4kappa型的人类单克隆抗体 LE2E9。这种抗体针对因子VIII的Cl结构域，并且抑制因子VIII的辅助因子活性和它与 von Willebrand 因子的结合(Jacquemin 等，(2000)Blood 95 156-163)。以同样的方法，分 离了针对因子VIII的C2结构域的人类单克隆抗体，称为B02C11 (IgG4kappa)，从患有血友 病A、具有抑制物的患者的记忆B细胞的库产生(Jacquemin等，Bloodl998 Jul 15 ；92 (2) 496-506)。B02C11识别因子VIII的C2结构域，抑制它与von Willebrand因子和与磷脂的 结合。它完全地抑制天然的和活化的因子VIII的促凝结活性。单克隆抗体的进一步的实 例是针对因子VIII的A2结构域的B0IIB2抗体。B0IIB2抗体抑制99%的因子VIII活性。 通过与A2结构域结合，它可以干扰并抑制FIXa的结合，它在FVIII的这个区域内含有低亲 和性结合位点，因而抑制FIXa的酶活性。作用的第二种设想的途径是干扰FVIII的异二聚 形式(A2:A1和A3:C1:C2)与FVIII的异三聚形式(A2和Al和A3 Cl C2)之间的平衡，通 过加速这些复合物的A2结构域的解离，使得它们无功能。(Ananyeva匪等，(2004)Blood Coagul Fibrinolysis. Mar. 15(2) 109-24. Review)。借助于这些新的工具，进一步的、更新近的针对因子VIII抑制物抗体的策略考 虑施用中和抑制物抗体的抗独特型抗体(具有与其他抗体的可变区相互作用的能力的抗 # ) (Saint-Remy JM 等，(1999) Vox Sang ;77 (suppl 1) :21_24)。小鼠抗独特型抗体，称为 14C12，在文献W02004/014955中公开，在体内以剂量依赖性方式中和抗因子VIII目标抗 体(单克隆抗体B02C11)的抑制性质，所述抗因子VIII目标抗体针对因子VIII的C2结构 域。抗因子VIII免疫反应是多克隆的，还开发了针对因子VIII的A2结构域的小鼠抗独特 型抗体(在专利申请FR 05 08320中描述)。A2结构域是43kD的结构域，它的功能不是公 知的，但已经表明了，针对因子VIII的A2结构域的抑制性抗体通过抑制过渡状态中复合物 FXase/FX 的转化来抑制因子 VIIIa 的功能(Lollar 等，J Clin Invest. 1994 Jun ；93 (6) 2497-504，Fay 等，J Biol Chem. 1996 ；271 (11) :6027_6032)。然而，针对因子VIII的免疫反应是多克隆的，因而，意味着抑制性抗体是针对不 同于A2和C2结构域的结构域的。实际上，即使抗因子VIII抗体的表位特异性的研究显示大部分抑制物识别因子VIII分子的有限的区域，位于重链的A2结构域和/或轻链的C2结 构域上，其他表位有时也被识别。实际上，来自患者的某些血浆含有能够结合因子VIII的 轻链的 Cl 结构域的抗体(Moreau 等，2000 ；95(11) :3435_441 Jacquemin et al, · 2000 ； 95(1) 156-162)。因而，总是需要进一步的工具，容许中和针对因子VIII的其他结构域的其他因子 VIII抑制性抗体，以更完整地中和血友病患者的抗因子VIII多克隆反应。因而，申请人试图开发用于治疗血友病A的新的工具，其允许中和针对因子VIII 的Cl结构域的抑制性抗体。发明的详细说明因而，本发明的第一个目标涉及针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特 型抗体，所述抑制性抗体是针对因子VIII的Cl结构域，这种抗独特型抗体具有所述抗体的 每条轻链的至少一个⑶R区域(互补决定区)，其中肽序列与选自序列SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :14的序列具有至少70%的同一性，并具有所述抗体的每条重链的至 少一个CDR区域，其中肽序列与选自序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11的序 列具有至少70%的同一性。所涉及的⑶R区域是⑶Rl和/或⑶R2和/或⑶R3区域。SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID N0:13禾口 SEQ ID NO :14 的序列根据Kabat 来定义[Kabat 等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，NIH Publication，91-3242(1991)]。在特别有益的实施方式中，与每种上述序列的同一性是至少80%，优选的至少 90%、95%、99%，更优选的100%。同一性的百分比通过排列要比较的两个序列并通过计算 具有相同氨基酸的位置的数目，用这个数目除以序列的氨基酸的总数来计算。在任何情况 下，这些序列差异完全不影响单克隆抗体对其目标的亲和性，或者它的功能。因子VIII “抑制性抗体”或“抑制物”是指抑制因子VIII的全部或部分促凝血活 性的抗体，即，通过与之结合，特别是其表位位于因子VIII上的抗因子VIII抗体。有益地， 本发明的抗体具有中和针对因子VIII的Cl结构域的抑制性抗体的至少20%、有益地至少 30 %、有益地至少40 %、有益地至少50 %、有益地至少60 %、在更有益的方法中，至少70 %、 80%、90%、99%或100%的凝结抑制活性，所述抑制性抗体是本发明的抗独特型单克隆抗 体的目标。中和抑制性抗体的凝结抑制活性的这种能力通过在例如“因子VIII发色团测 试” (Jacquemin等(1998) Blood 92. 494-506)的分析中测量存在抑制性抗体和抗独特型抗 体的情况下因子VIII的活性来测定。“抗独特型抗体”的表述是指针对目标抑制性抗体的可变区的抗体。在本发明的特 定的方面，本发明的抗独特型抗体针对抑制性抗体，其中所述抗体的重链的可变区涉及种 系DP-10。这种抑制性抗体可以通过用因子VIII或来自因子VIII的的片段，更特别地用 包含Cl结构域的全部或部分的片段来免疫，从人类(例如，来自含有抑制性抗体的患者血 清)或其他动物物种，例如，来自非限制性的列表的小鼠、马、山羊、非人灵长类获得。有益地，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体识别处于天然结构中的Cl结 构域。有益地，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体不识别作为R2150H突变的相同的 结构域。
本发明的单克隆抗独特型抗体是人类或动物来源的。此外，它可以使用多种不同 的方法获得。例如，产生抗独特型抗体的细胞可以从具有抗因子VIII抑制性抗体的患者的 外周血淋巴细胞、或从健康人获得。这些细胞可以通过本领域技术人员公知的技术永生化， 并根据生产抗独特型抗体的能力来选择，以中和针对因子VIII的抑制性抗体。生产本发明 的单克隆抗独特型抗体的进一步的方法是通过动物、有益地为小鼠，的免疫，通过注射针对 因子VIII的Cl结构域的因子VIII抑制性抗体、然后通过融合脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞 系，有益地为小鼠骨髓瘤，随后鉴定和克隆产生针对因子VIII抑制性抗体的抗独特型抗体 的细胞培养物。在本发明的优选的实施方式中，本发明的抗独特型抗体的轻链的每个CDR区域含 有与分别确定为SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ IDNO 14的序列至少70%同一性的 肽序列，所述抗体的每条重链的每个⑶R区域含有与分别确定为SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10和SEQ IDNO 11的序列至少70%同一性的肽序列。因而，本发明的抗体的每条轻链的⑶Rl区域含有与SEQ ID NO 12的序列具有至 少70%同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列ArgAla Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn，本发明的抗体的每条轻链的⑶R2区域含有与SEQ ID NO 13的序列具有至少70%同一 性的肽序列，其中后者具有氨基酸序列Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser，本发明的抗体的每 条轻链的⑶R3区域含有与SEQ ID NO :14的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中后者 具有氨基酸序列Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met LeuThr，本发明的抗体的每条重 链的⑶Rl区域含有与SEQ ID NO 9的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中后者具有 氨基酸序列Gly Tyr ThrPhe Thr Thr Tyr Trp Met His，本发明的抗体的每条重链的CDR2 区域含有与SEQ ID NO :10的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中后者具有氨基酸序 列 Tyr lie Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn PheLys Asp,本发明的 抗体的每条重链的⑶R3区域含有与SEQ ID NO 11的序列具有至少70%同一性的肽序列， 其中后者具有氨基酸序列 Ser GlyAla Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser。在特 别有益的方式中，与每种上述序列的同一性是至少80 %，优选的至少90 %、95 %、99 %，更 优选的100%。有益地，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区由与核酸序列SEQ ID NO 16具有至少70%同一性的核酸序列编码，其中后者具有下列氨基酸序列caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcacaatgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaagccaggatcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggcagtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactgccagcagtgg agtagtaacc cacccatgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaac，所述单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区由与核酸序列SEQ IDNO 15具有至 少70%同一性的核酸序列编码，其中后者具有下列氨基酸序列caggtccagc t tcagcagtc tggggctgaa c tggcaaaac ctggggcctc agtgaagatgtcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagaggcctggacagg atctggaatg gattggatac attaatccta cctctggtta tactgagtac aatcagaacttcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctacatgcaactgaacagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgggg gcctactataggtacgacga tgctatggac tcctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcag。对于本发明来说，信号肽可以添加到序列SEQ ID N0:15和SEQ IDN0:16来分别产 生例如序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，其中本发明的抗体的活性或特异性都不受这种 信号肽的影响。SEQ ID NO 1的序列对应于下列核酸序列atgggatgga gctggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccaggtccagcttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcctgcaaggctt ctggctacac ctttactacc tactggatgc actggataaa acagaggcctggacaggatc tggaatggat tggatacatt aatcctacct ctggttatac tgagtacaat cagaacttcaaggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg caactgaacagcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgggggcc tactataggtacgacgatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagoSEQ ID NO 2的序列对应于下列核酸序列atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctattca gtgcctcagt cataatgtccagaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaaggtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagaagccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttcagtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatgctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccacc catgctcacg ttcggtgctgggaccaagct ggagctgaaa C0在特别有益的方式中，所述序列同一性是至少80%，优选的至少95到99%。同一 性的百分比通过排列要比较的2条序列并通过计算含有相同核苷酸的位置的数目，用这个 数目除以序列的核苷酸的总数来计算。遗传密码简并性产生了相同的氨基酸可以由不同的 核苷酸的几种三联体来编码的事实。在任何情况下，单克隆抗体对其目标的亲和性以及它 中和目标抑制性抗体的抑制活性的能力都完全不受这些序列差异的影响。在本发明的优选的方面，所述单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区由核酸序 列SEQ ID NO :16编码，所述单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO 15编码。在有益的方式中，本发明的抗体的每条轻链可变区的肽序列是与序列SEQ ID NO 18具有至少70%同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%同一性的序列。其 中后者具有下列氨基酸序列Gln lie Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro Gly GluLys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn LeuAla Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr SerLeu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTrp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys0对于本发明来说，信号肽可以添加到例如序列SEQ ID N0:17和SEQID N0:18来分别产生例如，序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，其中本发明的抗体的活性或特异性都不受 这种信号肽的影响。在有益的方式中，本发明的抗体的每条重链可变区的肽序列是与序列SEQ ID NO 3具有至少70%同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%同一性的序列。其 中后者具有下列氨基酸序列Met Gly Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly ValHis Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly AlaSer Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp MetHis Trp lie Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie AsnPro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr LeuThr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr SerGlu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr AspAsp Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser0在特别有益的方式中，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是与序列SEQ ID NO 4 具有至少70 %的同一性、有益地至少80 %或90%、再更有益地至少99%的同一性的序列， 本发明的抗体的每条重链的肽序列是与序列SEQ ID NO :3具有至少70%的同一性、有益地 至少80 %或90 %、再更有益地至少99 %的同一性的序列，优选的，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是序列SEQ ID NO :4。其中后者具有 下列氨基酸序列MetAspPheGlnValGlnliePheSer Phe Leu Leu Phe Ser Ala Ser.ValIleMet SerArgGlyGlnlieValLeuSerGlnSer Pro Ala lie Leu Ser Ala SerPro GlyGlu LysValThrMetThrCysArgAlaSerSer Ser Val Ser Tyr MetAsn TrpTyr GlnGln LysProGlySerSerProLysProTrplie Tyr Ala ThrSer Asn Leu AlaSer GlyVal ProAlaArgPheSerGlySerGlySerGly ThrSer Tyr Ser Leu Thr lieSer ArgVal GluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCys Gln Gln Trp Ser Ser Asn ProPro MetLeu ThrPheGlyAla Gly Thr LysLeu Glu Leu Lys. 优选的，本发明的抗体的每条轻链的肽序列是序列SEQ ID NO :3。从序歹Ij SEQ ID NO 16推出的肽序列是序列SEQ ID NO 18，从序列SEQ ID NO 15 推出的肽序列是SEQ ID N0:17。其中后者具有下列氨基酸序列Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala SerVal Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met HisTrp lie Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn ProThr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu ThrAla Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser GluAsp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp AspAla Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser。优选的，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可变区具有肽序列 SEQ IDNO :18，本发明的单克隆抗独特型抗体的每条重链的可变区具有肽序列SEQ ID NO 17。在优选的方式中，本发明的抗独特型抗体的目标抑制性抗体是以登记号LMBP6165CB、由Collen研究基金会于2004年8月保藏在比利时微生物/质粒保藏协作保藏 所(BCCM/LMBP), Laboratorium voorMoleculaire Biologie, University of Ghent, Technologiepark 297，B_9052Zwi jnaarede的抗体RHD5。这种抗体，以及它的核苷酸和肽 序列在专利申请W02005/106455中描述。抗体RHD5是针对因子VIII的Cl结构域的人类 单克隆IgGl抗体，最初从患有血友病A、即具有高水平抑制物的获得性严重血友病A的患者 的淋巴细胞产生。这个抗体属于IgGl亚类，来源于种系DP-10。在因子VIII上所述抗体识 别的表位是处于其天然结构的Cl结构域，而不是与R2150H突变相同的结构域。抗体RHD5 可以抑制高达98%的因子VIII活性。本发明的抗体还涉及具有本发明的特征的任何修饰的抗体，其中一个或多个氨基 酸被替换或删除。这种替换或删除可以位于分子中的任何位置。在几个氨基酸被替换或删 除的情况下，可以考虑替换或删除的任何组合。可以进行本发明的抗体的可变区的这种序 列修饰以提高可能与本发明的抗独特型抗体或与目标抑制性抗体接触的残基的数目。在本发明的一个实施方式中，所述抗独特型抗体是小鼠抗体(anticorps murin)。有益地，这种小鼠单克隆抗独特型抗体是IgGlkappa。优选的，本发明的单克隆抗体是嵌合抗体。“嵌合抗体”的表述，要理解为它是指一 种抗体，其中轻链和重链的可变区属于与轻链和重链的恒定区不同的物种。因而，本发明的 抗体还含有属于非鼠物种的轻链和重链的恒定区。就此来说，能够使用所有的非鼠哺乳动 物科和种，特别是，例如，人、猴、鼠科(除了小鼠)、猪科、牛科、马科、猫科、犬科以及禽类。本发明的嵌合抗体可以使用本领域技术人员公知的重组ADN的标准技术来构建， 更特别地通过使用例如 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,81. pp. 6851-55 (1984) 所描述的“嵌合”抗体构建技术，其中利用重组ADN技术来使用人类免疫球蛋白的相应区域 替换来自非人哺乳动物的抗体的重链的恒定区和/或轻链的恒定区。在本发明的特定的方面，本发明的抗体是人类杂交抗体，也就是说嵌合抗体，它的 恒定部分是人类的。本发明的这个实施方式允许降低抗体在人类中的免疫原性，从而改善 它在向人治疗性施用时的效力。有益地，本发明的抗体是人源化的抗体。这种抗体可以通过将非人物种的单克隆 抗体的一个或多个CDR区域(互补决定区)与人类框架区域(可变区的高度保守区域，称 为框架)相连来获得，这种制造过程在本领域中已经讨论了(Jones等，Nature (1986) 321 522 ；Riechmann等，Nature (1988) 332 323)。这种针对识别FVIII的Cl结构域的抑制性抗 体的可变区的人源化抗体可以含有人类框架区域和序列SEQ ID N0:9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ IDNO 14 的一个或多个 CDR 区域。一种本发 明的特定人源化的抗体是针对识别FVIII的Cl结构域的抑制性抗体的可变区的人源化抗 体，其 CDR 区域是序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO 14 的区域。在有益的方式中，本发明的单克隆抗独特型抗体是2006年1月24日以登记号 码CNCM 1-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes) (CNCM,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)18B6 产生的抗体18B6。单克隆抗独特型抗体18B6的每条轻链的可变区由核酸序列SEQ ID N0 16编码，单克隆抗独特型抗体18B6的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO 15编码。获得杂交瘤18B6的方法在本文件的“实施例”部分中描述。本发明的单克隆抗独特型抗体还涉及包含抗体18B6的片段的任何抗体，更特别 地，包含抗体18B6的轻链可变区和/或重链可变区的任何抗体，或抗体18B6的轻链可变区 和/或重链可变区的任何片段。“片段”的表述，是指F(ab' )2片段或Fab'片段或Fab片 段或CDR区域、或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。在本发明的特定的实施方式中，本发明的单克隆抗独特型抗体是F(ab' )2片段 或Fab'片段或Fab片段或CDR区域，或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。使用木瓜 蛋白酶的免疫球蛋白酶消化产生2个相同的称为“Fab片段”(抗原结合的片段)的片段和 Fc片段(可结晶部分)。Fc片段是免疫球蛋白的效应物功能的支持。使用胃蛋白酶消化，产生F(ab' )2片段，其中两个Fab片段保持被两个二硫键连 接，Fc片段被分成几个肽。F(ab' )2片段由两个Fab'片段形成(一个Fab'片段由Fab 和绞链区组成)，由相互链接的二硫键连接来形成F(ab' )2。含有抗体的结合位点的这些片段，也可能丧失产生它们的完整抗体的某些性质， 例如，活化补体、或结合Fcgamma受体的能力。然而，这些片段没有丧失完整抗体中和抑制 性抗体的能力。因而，本发明还涉及抗体18B6的F(ab' )2、Fab'、Fab片段，或涉及⑶R区 域，或任何这些片段或区域的任何修饰的形式。特别地，这些片段保持了完整抗体中和RHD5 抗体的能力。本发明的进一步的目的是产生例如如上所述的抗体的稳定的细胞系。本发明的稳 定的细胞系可以是人类或动物来源的。本发明的稳定的细胞系可以来源于人类永生细胞。 在本发明的进一步的实施方式中，这种细胞系可以来源于动物来源，例如小鼠的永生细胞。 在本发明的这个实施方式中获得的细胞系的优选的实例是以编号1-3559保藏在CNCM的细 胞系18B6。在进一步的实施方式中，本发明的稳定的细胞系是一种细胞系，其在基因组的 期望的位点整合了容许本发明的抗体的表达的遗传构建体。获得这种细胞的步骤是稳定转 染。这种步骤可以应用于任何类型的细胞，只要它们能够维持在体外培养中。稳定的转染 需要遗传构建体的整合，其可以通过同源重组或随机地进行。例如，在包含为细胞赋予抗生 素抗性的感兴趣的基因的遗传构建体中的阳性选择盒的存在，证明了转基因向细胞基因组 中的插入。作为亚克隆步骤的结果，从本发明的抗体获得长期的生产细胞系，例如18B6，其 可以在体外培养中维持。表达本发明的抗体的稳定的细胞系可以选自由人类细胞系、啮齿动物细胞系，例 如小鼠细胞系、SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或任何人类来源的其他细 胞例如 PERC6、CHO 细胞系，特别地 CHO-K-U CHO-LeclO, CHO-LecU CHO-Lec 13, CHOPro-5、 CHO dhfr-(CHO DX Bl 1，CHO DG44)构成的组，或是选自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、 C0S-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的进一步的细胞系。本发明的进一步特别的主题是以登记号码CNCM 1-3559保藏在微生物培养物国家 保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6。由杂交瘤18B6产生的单克隆抗独特型抗体的每条轻链的可 变区由核酸序列SEQ ID NO :16编码，由杂交瘤18B6产生的单克隆抗独特型抗体的每条重 链的可变区由核酸序列SEQ ID NO 15编码。杂交瘤18B6产生的抗体是抗体18B6，在本文 件的“实施例”部分中描述了获得杂交瘤18B6的方法。本发明的进一步的主题是编码本发明的抗体的重链可变区的序列SEQ ID NO 15的ADN片段，例如早先所描述的。这种ADN片段可以插入到允许多肽、优选抗体的表达的 载体中，所述抗体的重链可变区由核酸序列SEQ ID NO: 15编码，其推出的序列是序列SEQ ID NO :17，以导入和维持在宿主细胞中。这种载体允许这种外源核酸片段在宿主细胞表达， 因为它含有这种表达所必需的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)。这种载体是本 领域技术人员公知的，可以是腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，这个列表不是限制性的。 此外，可以使用任何哺乳动物，例如宿主细胞，其是表达本发明的多肽或抗体的细胞，例如 SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或人类来源的任何其他细胞例如PERC6、 CHO 细胞系，特别地 CH0-K-1、CH0-Lecl0、CHO-Lecl、CH0-Lecl3、CHO Pro_5、CH0 dhfr-(CHO DX BlUCHO DG44)，或选自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK、K6H6、NSO、 SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的其他细胞系。本发明的进一步的目标是编码本发明的抗体的轻链可变区的序列SEQ ID NO 16 的ADN片段，例如早先所描述的。这种ADN片段可以插入到允许多肽、优选抗体的表达的 载体中，所述抗体的轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO :16编码，其推出的肽序列是序列 SEQ ID NO :18，以导入和维持在宿主细胞中。这种载体允许这种外源核酸片段在宿主细胞 表达，因为它含有这种表达所必需的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)。这种载 体是本领域技术人员公知的，可以是腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，这个列表不是限 制性的。此外，可以使用任何哺乳动物细胞作为宿主细胞，其是表达本发明的多肽或抗体的 细胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤例如Namalwa，或人类来源的任何其他细胞例 如 PERC6、CHO 细胞系，特别是 CH0-K-1、CHO-LeclO, CHO-LecU CHO-Lec 13, CHO Pro_5、CHO dhfr- (CHO DX Bll、CH0DG44)，或选自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK、 K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的其他细胞系。本发明的进一步的目标是药物组合物，其包含本发明的抗体和至少一种赋形剂和 /或至少一种药学上可接受的载体。优选的，本发明的药物组合物中含有的单克隆抗独特型 抗体是抗体18B6、来自18B6的片段或区域、或包含18B6的可变区或CDR的嵌合抗体或人 源化抗体，以及在本文件中早先描述的那些。本发明的药物组合物可以被配制入可以被要 治疗的患者耐受任何赋形剂。这种赋形剂的实例包括水、盐水溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶 液，以及任何其他适合的水性生理溶液。赋形剂也可以含有少量的添加剂，例如，提高等渗 性和组合物的稳定性的物质。这种赋形剂包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲 液。这种赋形剂是本领域技术人员公知的。标准制剂可以是用于注射的液体形式，或固体 制剂，其可以在施用之前重悬浮在适合的液体中。用于制备本发明的药物组合物的有用的 载体有益地具有提高治疗组合物在动物或患者中的半衰期的功能，或允许活性成分的控制 释放的功能。这种载体可以是能够以正常速度散布药物的、或仅在某些环境中散布药物的 有机和合成的聚合物、以及进一步的化合物，也可以是脂质体，这个列表不是限制性的。有益地，本发明的药物组合物，此外至少包含针对抑制性抗体的抗独特型抗体，所 述抑制性抗体结合因子VIII的不同于Cl结构域的结构域。这种其他的抗体可以是针对抑 制性抗体的抗独特型抗体，所述抑制性抗体结合因子VIII的Al、或A3、或B、A2或C2结构 域。实际上，发展出抑制性抗体的、患有血友病A的患者最经常地展现几种类型的抑制性抗 体。此外，不同类型的抑制性抗体的数量和性质是不固定的，在患者的生命期中可以改变。 因而，同一患者的不同的抑制性抗体针对因子VIII的不同结构域，特别有益的不是使用一种、而是使用针对不同抑制性抗体的几种类型的抗独特型抗体来治疗患者。优选的，所述药物组合物包含针对结合因子VIII的C2结构域的抑制性抗体、和/ 或结合因子VIII的A2结构域的抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，以及本发明的单克隆 抗体。实际上，A2和C2结构域是抗因子VIII免疫反应的主要目标。因而，包含针对结合 因子VIII的Cl结构域的抑制性抗体的抗独特型抗体以及针对结合C2结构域的抑制性抗 体的抗独特型抗体的混合物的药物组合物，允许中和患者中存在的至少70%、有益地至少 80%或90%的全部抑制性抗体。在本发明的优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含 抗体14C12 (在比利时协作微生物保藏所以编号LMBP 5878CB保存)和/或抗体30D1 (在 CNCM以编号1-3450保藏)。在本发明的进一步优选的实施方式中，所述药物组合物包含以 编号1-3510在CNCM保藏的嵌合抗体14C12，和/或衍生自抗体30D1的嵌合的或人源化的 抗体，其是包含抗体30D1的可变区的抗体。本发明的进一步的目的是本发明的抗体作为药物的用途。本发明的进一步的目的是本发明的抗体用于制造药物的用途。有益地，这种药物 被用于在患有血友病、包含针对因子VIII的Cl结构域的抑制性抗体的患者中降低和/或 防止和/或治疗出血。本发明的进一步的目的是本发明的抗体用于制造用于治疗A型血友病的药物的 用途。有益地，这样治疗的A型血友病是具有抑制物的血友病。用本发明的抗体治疗的 这种类型的血友病可以是先天的或获得性的。通过中和抑制性抗体，本发明的抗体使得通 过向患者注射因子VIII的治疗是有效的，因为因子VIII的活性不再被抑制性抗体抑制。本发明的进一步的目标是本发明的抗体用于中和针对因子VIII的Cl结构域的抑 制性抗体的体外或体内抑制活性的用途。可以进行这种过程来从患者的血液中耗尽针对因 子VIII的Cl结构域的抑制性抗体，然后向所述患者重新注射处理过的血液。本发明的进一步的目标涉及包含本发明的抗体、优选的抗体18B6的药物。本发明的进一步的目的是所述抗体用于吸附抑制性抗体的用途，例如，用以纯化 因子VIII抑制性抗体。最后，本发明的进一步的目标是本发明的抗体用于检测和/或纯化因子VIII抑制 性抗体的用途。进行这种检测方法和纯化的一般过程是本领域技术人员公知的。举例来说， 可以提及的是使用含有珠子的免疫纯化柱，所述珠子具有嫁接到它们表面上的本发明的抗 体。仅被抗体识别的分子将自身吸附到所述珠子上。其他的将穿过所述柱。为了回收所述 分子，提高的溶剂离子强度是足够的。本发明的进一步的方面和益处将在以下实施例中描述，其将被认为是例示而不是 限制本发明的范围。


附图1 对于4只小鼠的抗独特型抗体与RHD5结合的提高(平均值)。附图2 抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合。附图3 抗体RHD5与不溶的重组FVIII (recFVIII)的结合的抑制作用。附图4 用18B6对RHD5的中和。实施例t施例 ι 针对因子 Yin 的 Ci(“杭 ci 杭体”)根据在文件Jacquemin 等(1998)，Blood 92，496-506 和专利申请 W02005/016455 中描述的操作，以下在此描述的人类淋巴样干细胞系通过患有获得性血友病A、发展了对因 子VIII的免疫反应的患者的B淋巴细胞的永生化来获得。产生单克隆抗Cl RHD5抗体的细胞系以登记号LMBP 6165CB、由Collen研究基金 会于2004年8月保藏在比利时微生物/质粒保藏协作保藏所(BCCM/LMBP) ,Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University ofGhent, Technologiepark 297，B-9052 Zwijnaarede, Belgium。RHD5抗体的重链可变区的核苷酸序列是序列SEQ ID NO :5，其中后者具有下列氨 基酸序列atggactgga cctggaggtt cctctttgtg ccagtcccaggtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg
gatggtctcctgcaaggctt acaggcccctggacaagggc aaacaccgcacggaacttcc agcctacatacgactgagga
ctggaggcac ttgagtgggt agaatagagt gcctgagatc
cttcagcagc gggagggatc caccattacc tgaagatacg
gtggcagcag aagaagcccg tttggtatca atccctatct gcggacgaat gccgtgtatt
ctgcaggtgt ggtcgtcggt gctgggtgcg ttggtacagc tcacgagcac actgtgtcgg
cggtcgagatgcctacagct ttgatggttt tgatgtctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca g,RHD5抗体的轻链可变区的核苷酸序列是序列SEQ ID NO :6，其中后者具有下列氨 基酸序列atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact gcacaggatc cgtggcctcctctgggctga ctcagccaca ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caacatcacctgctctagag ataagttggg tcataaattt gcttcctggt atcaacagaa gccaggccag tcccctgctcttctcatcta tcaagacagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctccaactctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat gaggctgactattactgtca ggcgtgggac aacaccactg ccgtattcgg cggagggacc aagttgacagtcctaagtca gccc&0相应于序列SEQ ID NO :5的肽序列是序列SEQ ID NO :7，其中后者具有下列氨基 酸序列Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Ala GlyVal Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe GlyIle Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Gly IleIle Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Thr Ala Arg Asn Phe Gln Asn Arg Val ThrIle Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr lie Arg Leu Arg Ser Leu ArgSer Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gly Gly Arg Asp Ala Tyr Ser PheAsp Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser，相应于序列SEQ ID NO :6的肽序列是序列SEQ ID NO :8，其中后者具有下列氨基 酸序列
Met Ala Trp lie Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly SerVal Ala Ser Ser Gly Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Val Ser Pro Gly GlnThr Ala Asn lie Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly His Lys Phe Ala Ser TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ala Leu Leu lie Tyr Gln Asp Ser LysArg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr AlaThr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys GlnAla Trp Asp Asn Thr Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr ValLeu Ser Gln Pro。或者，具有需要的性质的抗体可以通过免疫动物来产生。在这种情况下，人类因子 VIII与佐剂注射到小鼠中。通过融合脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系来获得单克隆抗人 类抗体。鉴定产生抗因子VIII抗体的细胞上清液，并通过限制稀释来克隆。这种方法的一 般性说明可以在 Current Protocols in Immunology, Chapter 2，John Wiley&Sons, Inc， 1994中找到。以下描述了具有期望的性质的抑制物的进一步选择。实施例2 抗独特型抗体18B6的产牛I.小鼠免疫四只6周龄Balb/c雌性小鼠用悬浮在完全弗氏佐剂(ACF)(第一次免疫)中的、 然后悬浮在弗氏不完全佐剂(AIF)中的IOyg FVIII RHD5抗体的人类抗Cl结构域在爪垫 中皮下地注射(SC)三次。第一次放血(放血0)在免疫之前(在第0天(JO)放血)进行，然后如下进行注 射和放血Jl 注射N° 1 (存在完全弗氏佐剂的情况下10 μ g RHD5抗体)J15 放血 N。1J16 注射N。2 (在存在弗氏不完全佐剂的情况下10 μ g RHD5抗体)J28:放血 N。2J29:注射N° 3 (在存在弗氏不完全佐剂的情况下IOyg RHD5抗体)J44:放血 N。3II.小鼠的免疫反应的评估为了评估不同的放血中抗RHD5抗体的存在，进行直接结合的ELISA分析。为此， 3 μ g/ml的RHD5抗体或对照IgGl进行不溶解化，50 μ g/孔，un甘氨酸缓冲液，在4°C过夜 (甘氨酸缓冲液=0. IM甘氨酸、0. 17M NaCl，pH 9. 2)。用PBS/Tween进行三次洗涤(PBS =140. OmM NaCl, 2. 6mM KCl, 1. 4mM KH2PO4,8. InM Na2HPO4. 2H20, pH 7.4)。系统在室温下 (RT)使用 100 μ 1/孔的 Magic 缓冲液(Magic 缓冲液=50mM Tris,0. 17M NaCl,l% BSA,pH 7. 2)保持饱和30分钟。后来，放出的血液在Magic缓冲液中稀释到1/10、1/100、1/1000和 1/10000，在室温下孵育2小时(50μ1/孔)。然后，在PBS/Tween中进行3次洗涤。随后， 系统与HRP (辣根过氧化酶)(Bio-Rad)标记的1 μ g/ml山羊多克隆小鼠抗IgG抗体在室温 系孵育2小时(50 μ 1/孔)(在Magic缓冲液中稀释)。然后，系统用PBS/Tween洗涤3次， 用发色团(邻-苯基二胺)进行显示，获得的颜色的强度使用具有相应于波长490/650nm 的滤光器的读出器读取(读出器Emax Molecular Devithese，Sunnyvale，CA)。使用对照IgGl获得的光密度的结果 表1使用RHD5获得的光密度的结果 表2获得的结果在附图1中描绘。结论每只小鼠正确地应答并与RHD5 Fab片段的注射类似地起反应。在任意的方 式中，选择小鼠n° 4来进行融合。III.融合和筛诜进行小鼠n° 4的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤SP2/0的细胞的融合。以对于本领域技 术人员常规的途径进行融合(J. G. Gilles 等，Blood(2004) 103 :2617_23 ；P. Cornells,((Les anticorps monoclonaux》，Revue IRE, vol.7, N° 4,1983)。根据有限稀释的原则将细胞在含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的DMEM培养基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)中连续地扩增，在直接结合ELISA分析中检测测试 为阳性的克隆，例如早先在II点中描述的那样。结合的特异性通过不溶解的具有非相关特异性、在实验室中生产的人类IgGl抗 体来确认。为了确定杂交瘤稳定性，以从200μ 1到5ml的不同培养基体积在克隆扩增期间重 复表位筛选测试(测试1到3)。测试1 =在200 μ 1的孔中测量测试2 =在Iml的孔中测量测试3 =在5mL的瓶中测量在不同的表位筛选期间获得的结果在以下表格中概述 表3IV.使用培养物上清液的抑制作用分析如在表3中所示，使用培养物上清液进行抑制作用的测试。进行这种分析来从克 隆中选择抗独特型抗体，其精确地识别定位于Ac RHD5的抗体决定簇水平上的表位决定簇。 在ELISA分析中测试所述抗独特型抗体对RHD5与不溶性FVIII的结合的抑制作用。在甘氨酸缓冲液中2 μ g/ml的重组因子VIII(recFVIII) (Baxter)，50 μ 1/孔进 行不溶解化，在室温下保持2小时。0. 6 μ g/ml终浓度的RHD5抗体(或不相关的IgGl)与 Magic缓冲液中稀释度1/1、1/2和1/4的培养物上清液预孵育2小时。反应孔用PBS/Tween 缓冲液洗涤3次，然后用100 μ 1/孔的Magic缓冲液饱和(在室温下30分钟)。以后，培养物上清液与50 μ 1的RHD5 (或不相关的IgGl)(在室温下2小时，Magic缓冲液)孵育， 然后，进行3次洗涤。通过添加50 μ 1/孔的Magic缓冲液中1 μ g/ml的小鼠多克隆人类抗 IgG HRP标记的(Southern Biotechnology)抗体的溶液，检测与不溶的recFVIII结合的 RHD5抗体。用PBS/Tween进行三次连续的洗涤，然后用发色团(0PD邻-苯基二胺)进行显 示，获得的颜色的强度使具有相应于波长490/650nm的滤光器的读出器读取(读出器Emax Molecular Devithese, Sunnyvale, CA)。结论如表3所示，11个克隆能够特异性地抑制与不溶解的recFVIII结合的RHD5抗体。 (N. B.阴性值，表示结合抗体决定簇的外部区域的可能性，或者反映培养物上清液中不足 的Ac浓度。然而，对于阳性的数目，根据以下的测试淘汰阴性孔)。V.式RHD5 秘··棚牛(_〒VIII)白術_
测量 在Magic缓冲液中，在37°C，以1 μ g/ml的浓度将RHD5抗体与在抑制作用测试期 间选择的不同克隆的上清液孵育(稀释3倍、6倍、12倍和24倍)。在30分钟之后，添加 0. 5U/mL终浓度的FVIII Kogenate (Bayer)，在37°C进行互补孵育30分钟。样品在Magic 缓冲液中稀释30X，然后根据厂家的说明书添加产色DADE测试的试剂(因子VIII产色的， Dade BehringGmbh, Marburg, Germany)。如在表3中所示，10个克隆能够中和Ac RHD5的抑制性活性。选择抗体18B6来按 以下过程使用，作为结果和中和曲线的函数。VI.选择的18B6抗RHD5克隆的扩大生产在DMEM培养基中生产抗独特型抗体18B6。这种生产继之以在蛋白G亲和柱上纯 化(其允许抗体的纯化、然后浓缩，因而进一步确定获得的抗独特型抗体特异性)。纯化18B6以 8. 48mg/ml 产生 8mlVII.特异性评估根据与II和IV点中描述的相同方案使用ELISA评估各个制品。1. ELISA分析抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合抗独特型抗体18B6与不溶的抗体RHD5的直接结合在附图2中说明。曲线显示了， 抗体18B6与RHD5的结合是剂量依赖性的。2. ELISA分析抗体RHD5结合不溶的重组FVIII的抑制作用。根据IV点中描述的方案测量RHD5抗体结合不溶的重组FVIII的抑制作用。使用 的RHD5的浓度等于2 μ g/ml。
20 表 4结果在附图3中示出。在2. 5的RHD5/18B6摩尔比下获得了 RHD5结合FVIII的 50%抑制，而等摩尔的比例抑制92%的这种结合。3.功能测试RHD5抗体抑制性活性(抗FVIII)的中和的测量方案与V点中描述的相同，最终的RHD5浓度0. 4 μ g/ml，纯化的抗独特型抗体的曲 线从4到0. 002 μ g/ml终浓度。结果在以下的表5中给出 表 5结果在附图4中说明。以等摩尔的RHD5/18B6比例获得了 RHD5抑制活性的50% 中和。4.使用“表面胞质团共振Biacor”方法的抗独特型抗体18B6的结合动力学测量利用 Pharmacia Biosensor BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suede) 通过使用“表面胞质团共振Biacore”方法评估了抗独特型抗体18B6对抑制物RHD5抗体的 结合动力学。RHD5抗体固定在CM5探针的活化的表面上。抗独特型抗体18B6浸入固定在 探针表面的不同的RHD5浓度中。测定缔合和解离常数
Ka(M-IS-I) = 4. 26xl03Kd(S-I) = 1. 45xl(T5Kd :Μ. 3. 4xl(T95.抗独特型抗体18Β6亚类的表征为了确定抗体18Β6的子集，使用Roche的IsoStrip系统(比色条带)。抗体18B6 被鉴定为IgGl Kappa。VIII.抗体18B6的序列为了进行测序，使用 Quick Prep Micro ARNm 纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suede)分离产生抗独特型抗体18B6的杂交瘤的ARNm。使用第一链ADNc 合成试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)合成ADNc。编码重链(VH)和轻链(VL)的ADNc 使用与小鼠中潜在存在的不同基因家族相应的特异性引物通过PCR(聚合酶链式反应)来 扩增。通过QIA quick Gel提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从1.5%的琼脂糖凝胶 分离PCR产物，用pGEM-T Easy载体系统(Promega, Madison, WI)克隆。阳性菌落的质粒 ADNfflil High PurePlasmid ^^i^^O^ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)分离’ M Seqenase (US Biochemical, Cleveland, OH)双向jftiil·。IX. 18B6抗体的特别的件质抗体1886完全地抑制1^05抗体结合它的抗原，因子￥111。RHD5抗体带有与18B6 的互补的独特型。抗体与抗原的结合涉及与多个氨基酸相应的6到12个埃2 (angstriims2)的相互 识别的对接，其通过氢键、疏水性或极性引力和范德华(VanderWals)桥相互缔合。在功能水平上，当抗体完全地抑制抗体与抗原的结合时，这意味着抑制性抗体带 有抗原的“内部图像”，也就是说，模拟抗原的3-D结构的三维结构。虽然18B6抗体的一级结构(氨基酸序列)显示了与因子VIII的Cl结构域的低 同一性，18B6抗体的二级结构与FVIII的Cl结构域的二级结构的比较、RHD5抗体的抗原性 目标、18B6的三维建模表明，通过与Cl结构域的3-D结果重叠，18B6的轻链(VL)的可变部 分呈现了 Cl结构域的内部图像。这种观察赋予了 18B6抗体特别的、新的和不可预见的性质。换句话说，通过用抗 体例如RHD5的免疫产生类似于18B6的抗体的任何努力事实上没有产生与18B6相同的抗 体。
权利要求
针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述抑制性抗体针对因子VIII的C1结构域，其特征在于所述抗体的每条轻链的至少一个CDR区域(互补决定区)含有与选自序列SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14的序列具有至少70％同一性的肽序列，以及其中所述抗体的每条重链的至少一个CDR区域具有与选自序列SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11的序列具有至少70％同一性的肽序列。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的每个CDR区域含有分别 与序列SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13和SEQID NO :14具有至少70%同一性的肽序列，以及 其中所述抗体的每条重链的每个⑶R区域具有分别与序列SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10和 SEQ ID NO 11具有至少70%同一性的肽序列。
3.根据权利要求1或2的任一项的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的可变区由 与核酸序列SEQ ID NO :16具有至少70%同一性的核酸序列编码，以及其中所述抗体的每 条重链的可变区由与核酸序列SEQ ID NO :15具有至少70%同一性的核酸序列编码。
4.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗体的每条轻链的可变区由核 酸序列SEQ ID NO: 16编码，以及其特征在于所述抗体的每条重链的可变区由核酸序列SEQ ID NO 15 编码。
5.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于其每条轻链的可变区的肽序列是具 有与序列SEQ ID NO :18至少70%的同一性的序列，以及其每条重链的可变区的肽序列是 具有与序列SEQ ID NO 17的至少70%的同一性的序列。
6.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于从序列SEQIDNO :16推出的肽序列 是序列SEQ ID NO :18，以及其特征在于从序列SEQ ID NO 15推出的肽序列是序列SEQ ID NO :17ο
7.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抑制性抗体是抗体RHD5(以编 号LMBP 6165CB保藏在保藏所BCCM/LMBP)。
8.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗独特型抗体是小鼠抗体。
9.根据权利要求8的抗体，其特征在于所述抗独特型抗体是IgGlkappa。
10.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于所述抗体是嵌合抗体。
11.根据权利要求10的抗体，其特征在于所述抗体是人类杂交抗体。
12.根据权利要求1到9的任一项的抗体，其特征在于所述抗体是人源化的抗体。
13.根据前述权利要求的任一项的抗体，其特征在于它为F(ab')2片段、Fab'片段、 Fab片段、CDR区域和这些片段或区域的任一个的任何修饰的形式。
14.根据前述权利要求1到9的任一项的抗体，其特征在于它能够由以登记号码CNCM 1-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6产生。
15.产生根据权利要求1到13的任一项的抗体的稳定细胞系。
16.根据权利要求15的稳定细胞系，选自由SP2/0、YB2/0、IR983F、人类骨髓瘤 Namalwa,PERC6、细胞系 CH0，特别是CH0-K-1、CHO-Lec 10、CHO-Lec 1、CHO-Lec 13、CHO Pro-5、 CHOdhfr-, Wil_2、Jurkat, Vero, Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK, K6H6、NSO, SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 构成的组。
17.以登记号码CNCM1-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6。
18.—种针对因子VIII人类抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述抑制性抗体针对由以登记号码CNCM 1-3559保藏在微生物培养物国家保藏所(CNCM)的杂交瘤18B6产生的 因子VIII的Cl结构域。
19.具有序列SEQID NO 15的ADN片段，所述序列SEQ ID NO 15编码根据权利要求 1到14的任一项的抗体的重链可变区。
20.具有序列SEQID NO 16的ADN片段，所述序列SEQ ID NO 16编码根据权利要求 1到14的任一项的抗体的轻链可变区。
21.药物组合物，包含根据权利要求1到14的任一项的抗体，和至少一种赋形剂和/或 至少一种药学上可接受的载体。
22.根据权利要求21的组合物，特征在于它包含针对抗FVIII抗体的至少一种抗独特 型抗体，所述抗FVIII抗体针对因子VIII的不同于Cl结构域的结构域。
23.根据权利要求21或22的任一项的组合物，特征在于它包含针对抗FVIII抗体和/ 或针对因子VIII的A2结构域的抗体的抗独特型抗体，所述抗FVIII抗体针对因子VIII的 C2结构域。
24.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于制造药物。
25.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于制造用于治疗A型血友病的药物。
26.根据权利要求25的用途，其中所述A型血友病是具有抑制物的血友病。
27.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于体外中和针对因子VIII的Cl 结构域的抑制性抗体的抑制活性。
28.根据权利要求1到14的任一项的抗体的用途，用于因子VIII抑制性抗体的体外检 测和/或纯化。
29.一种包含根据权利要求1到14的任一项的抗体的药物。
全文摘要
本发明涉及针对结合因子VIII的C1结构域的因子VIII抑制性抗体的抗独特型单克隆抗体，还涉及产生这种抗独特型单克隆抗体的细胞系，涉及所述抗独特型单克隆抗体作为药物的用途，以及更特别地涉及它用于制造用于治疗血友病A的药物的用途。
文档编号C12N15/13GK101883793SQ200780101219
公开日2010年11月10日 申请日期2007年8月23日 优先权日2007年8月23日
发明者C·贝伦斯, J·-G·吉尔斯, J·-M·圣-雷米, M·G·杰奎明 申请人:Lfb生物科技公司