专利名称：：大肠杆菌基因appA在培育转基因作物中的应用及培育法的制作方法
技术领域：
：本发明属于作物育种和基因工程领域，涉及一种基因的新型功能。具体地讲，涉及大肠杆菌的植酸酶基因(叩pA)在转基因作物中的应用，即一种土壤有机磷利用型转基因作物的培育方法。
背景技术：
：磷(phosphorus,P)是植物生长和发育必需的大量营养元素之一。土壤中总磷含量十分丰富，主要以有机磷和无机磷这两种形式存在。植物根系只能吸收以H2P04—为主的磷酸盐(Schachtmanetal.,1998;Vanceetal.,2003)，而不能直接利用占土壤总磷含量20-80%的有机磷。因而全世界30%以上的耕地存在着缺磷问题，使作物生长受到限制。解决土壤缺磷的问题常见的措施是施用大量无机磷肥来满足作物生长的需要，但磷肥的大量施用不仅会耗竭有限的、不可再生的磷矿资源，而且还会引起环境污染，威胁生态平衡。土壤有机磷主要包括植酸(phyticacidorphytate,又名肌醇六磷酸酉旨myo-inositolhexaphosphoricacid)、核酸和磷脂三类，约占有机磷总量的50%。植酸主要以钙镁复盐(植酸钙镁phytin)的形式存在于植物种子及其胚芽中。土壤中富集的植酸能在植酸酶的作用下分解成肌醇和磷酸，从而被植物所吸收利用。但大多数植物中的植酸酶的合成过程只有在种子萌发时才能被激活，且没有向根际土壤分泌，因而，植物很难借助自身合成的植酸酶来有效地吸收根际的植酸(Brinch-Pedersenetal.，2002)。最早被克隆的植酸酶基因是黑曲霉(Aspegillusniger)NRRL3135的p/z^(Vanetal.,1993)。虽然之前的研究发现某些植物具有磷酸酶(Hayesetal.,1999)，但是并不清楚这种酶在细胞外是否具有活性，也不清楚能否帮助植物分解利用根际的植酸。近几年的研究表明当提供适当的信号肽时，来自黑曲霉的植酸酶可以在植物中表达，并能向胞外分泌(Brinch-Pedersenetal.2000;Lietal.1997;Richardsonetal.2000,2001)。Xiao等(2005)还成功地利用来自苜蓿的植酸酶基因有效地提高了拟南芥的有机磷利用率。研究表明，当植酸作为单一磷源时，大多数的转基因植物都能有效地降解水培和琼脂培养基中的植酸，但这些转基因植物是否能降解土壤中的有机磷，还没有明确的定论。同时，植酸是一种抗营养因子，它能螯合Fe、Zn等微量元素。而铁在植物营养和人类健康中都有非常重要的作用。现今，世界上由于农作物缺铁而导致的铁摄入量不足的人口数量已经达到了十亿。降低种子中的植酸含量，能帮助释放与植酸结合的Fe、Zn、Cu等人体所需微量元素；因此，这对实际的生产具有一定的应用价值。a邵j(GenBankaccessionnumber:AF537219)就是分离自大肠杆菌(&c/jm'c/^co//)的植酸酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，该基因编码的蛋白质具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。目前，印p4的主要用途是用于广泛应用于饲料行业中，它作为一种词料添加剂，能够帮助单胃动物有效地分解利用饲料中的植酸，同时降低了动物排泄物所引起的磷污染的发生概率。'上述参考文献具体如下Brinch-PedersenH,SorensenLD,HolmPB.2002.基因工程改造作物提高其磷利用率，植物禾斗学动态7:118-125(Engineeringcropplants:gettingahandleonphosphate.TrendsPlantSci7:118-125)。Brinch-PedersenH,OlesenA，RasmussenSK，HolmPB.2000.得到组成型表达植酸酶基因的转基因小麦，分子育种6:195-206(Generationoftransgenicwheat(TriticumaestiviunL.)forconstitutiveaccumulationofanAspegillusphytase.MolBreeding6:195-206)。DharmsthitiS，ChaiermpornpaisarnS,KiatiyajamM,ChanpokapaiboonA,KlongsithidejY，TechawiparutJ.2005.表达大肠杆菌植酸酶基因appA的假单胞菌中生产植酸，生化过程40:789—793(Phytaseproductionftom户sewcfono打asharboringj￡yc/m'c//""p/A.ProcessBiochem.40:789—793)。HayesJE，RichardsonAE,SimpsonRJ.1999.牧草根系提取物和豆科小苗中植酸酶和酸性磷酸酶活性的检测，澳大利亚植物生理学杂志26:801-809(Phytaseandacidphosphataseactivitiesinextractsfromrootsoftemperatepasturegrassandlegumeseedlings.AustJPlantPhysiol26:801-809)。RichardsonAE,HadobasPA,HayesJE.2000.小麦根系酸性磷酸酶和植酸酶的活性与其植株在灭菌培养中对于有机磷的利用，植物细胞与环境23:397-405(Acidphosphomonoesteraseandphytaseactivitiesofwheat(TriticumaestivumL.)rootsandutilizationoforganicphosphorussubstratesbyseedlingsgrowninsterileculture.PlantCellEnviron23:397-405)。RichardsonAE,HadobasPA,HayesJE.2001.转基因拟南芥根部表达外分泌黑曲霉植酸酶基因使得其能够利用植酸中的磷素，植物学杂志25:641-649(ExtracellularSecretionofAspegillusphytasefromArabidopsisrootsenablesplantstoobtainphosphorusfromphytate.PlantJ25:641-649)。SchachtmanDP，ReidRJ,AylingSM.1998.植物吸收磷素从土壤到细胞，植物生理116:447~453(PhosphorusUptakebyPlants:FromSoiltoCell.PlantPhysiol116:447453)。vanderRestB，BoissonAM,GoutE,BlignyR,DouceR.2002.高等植物细胞中甘油磷酸胆碱的代谢发现一种新的甘油磷酸歧化酶，植物生理130:244-255(Glycerophosphocholinemetabolisminhigherplantcells.Evidenceofanewglyceryl-phosphodiesterphosphodiesterase.PlantPhysiol130:244—255)。VanceCP,Uhde-StoneC,AllanDL.2003.植物磷吸收和对于非可再生资源的有效利用的关键适应性，新植物学家157:423-447(Phosphorusacquisitionanduse:criticaladaptationsbyplantsforsecuringanonrenewableresource.NewPhytol157:423~447.)。XiaoK,HarrisonMJ,WangZ.2005.转基因表达一种新的植酸酶基因使得拟南芥提高了对有机磷的吸收效率。植物学222:27-36(TransgenicexpressionofanovelM.truncatulaphytasegeneresultsinimprovedacquisitionoforganicphosphorusbyArabidopsis.Planta222:27-36.)。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌基因邻，/"的新用途，即在培育土壤有机磷利用型转基因作物中的应用。为了解决上述技术问题，本发明提供一种大肠杆菌基因邻!pj在培育转基因作物中的应用用于培育土壤有机磷利用型转基因作物。本发明还同时提供了上述培育方法，包括以下步骤1)、选用大肠杆菌基因邻一，该基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；2)、选用胡萝卜外展蛋白的信号肽，该信号肽具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；3)、外分泌型植酸酶转基因载体的构建将花椰菜花叶病毒35S启动子、胡萝卜外展蛋白的信号肽、大肠杆菌基因邻^^与根癌农杆菌章鱼碱合成酶基因终止子Tocs正向串联连接，获得过量表达外分泌型ap/^基因的表达框，从而获得转基因载体p35S-appA;4)、将所述转基因载体p35S-appA导入农作物中，从而获得转基因作物。作为本发明的土壤有机磷利用型转基因作物的培育方法的改进农作物为水稻。大肠杆菌基因邻A4是一种能使水稻具有良好植酸酶活性的基因，其编码的蛋白质具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明采用具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。采用本发明的培育方法所获得的农作物为土壤有机磷利用型转基因其作物，即能吸收利用土壤中的植酸。将含有appA基因的表达载体通过农杆菌介导的方法转化水稻细胞，获得转基因水稻植株。该植株能进行正常的生长发育和结实，结实率和千粒重都没有明显的差异。但是，通过对该植株根部和籽粒植酸酶活性的测定发现，转基因水稻中植酸酶活性相对与野生型大大提高(表1,2);对植株籽粒植酸含量的测定发现转基因水稻中植酸含量相对于野生型显著降低(表3)。植酸酶的测定方法如下:将样品磨成均匀的粉末，溶于5倍体积(w/v)的Buffer1(15mMMES,0.5mMCaCl2，ImMEDTA)中。12000g，4。C，离心10分钟，吸取上清。取250提取液，加入IHP(终浓度为2mM),用BufferII(15mMMES,0.5mMCaCl2)定容至500h1。27°C反应1小时，立即加入等体积10%tca终止反应。12000g离心10分钟，取上清，用钼蓝法测定其882nm(或者700nm)处的光吸收值。根据标准曲线及其方程计算出样品中的植酸酶活性。植酸含量的测定如下称取O.lg样品米粉于50ml离心管中，加入7ml0.2NHCL，在常温下振荡2小时以上提取，10000rpm离心10分钟。吸取0.5ml上清液于1.5ml离心管中，加入lml铁(ra)溶液，盖上离心管，混合，在沸水浴中反应30分钟。冰浴约5分钟使得温度降到室温。3000g离心30分钟。吸取lml上清液到另一4ml离心管中，加入1.5ml2，2，-联吡啶溶液，混合，立即在519nm处测量光吸收值，根据标准曲线及其方程计算出样品中的植酸磷含量。表l、转基因及野生型水稻根抽提液中植酸酶酶活(所示值为平均数±标准差，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2、转基因(2个株系)及野生型水稻种子中植酸酶酶活(所示值为平均数±标准差，n-3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3、转基因(2个株系)及野生型水稻种子中各种形式磷的含量(所示值为平均数±标准差，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>综上所述，采用本发明方法所得的appA转基因水稻，能充分吸收利用土壤中的植酸，且能降低籽粒内的植酸含量。水培条件下，我们设计了不同磷源处理分别用NaCl、植酸(phyticacid)和NaH2P04作为磷源(即无磷、有机磷和无机磷三种磷源)。正常营养液(1.425mMNH4N03，0.323mMNaH2P04，0.513mMK2S04，0.998mMCaCl2，1.643mMMgS04，0.009mMMnCl2，0.075mM(NH4)6Mo702，0.019mMH3B03，0.155mMCuS04，0.036mMFeCl3，0.070mMcitricacid，0.152mMZnS04,pH5.5，Yoshidaetal.1976)中生长14天的处理转基因植株和野生型植株转至不同磷源的营养液(无磷一lOmMNaCl;植酸磷一10mM磷含量的IHP;正常供磷一10mM磷含量的NaH2PO4，其他成分含量同正常营养液)中培养14天。培养条件12hr光照(28'C)A2hr暗培养(22。C)，湿度60%。培养14天后测定植株地上部的无机磷浓度。在正常供磷和无磷条件下，转基因株系和野生型的无机磷含量均无显著性差异，在植酸磷条件下，appA转基因株系无机磷含量显著高于野生型(图2)。土培条件下，我们设计了不同磷源处理分别用植酸(phyticacid)和NaH2P04作为外源追加磷源，即低磷、植酸磷和正常供磷三种磷水平，其他追加氮肥、钾肥量相同，见下表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>正常营养液中生长14天的处理转基因植株和野生型植株转至不同磷源的盆钵中培养45天。培养条件12hr光照(28。C)/12hr暗培养(22'C)，湿度60%。每隔15天检测植株株高、分蘖和无机磷含量。从株高和分蘖情况(数据未给出)来看，转基因植株和野生型并无显著性差异。我们以正常供磷条件下各植株的无机磷含量为参照，重新计算了低磷和植酸磷条件下不同时期不同株系无机磷的含量(图3)。结果，我们发现无论是低磷还是植酸磷条件下，植酸酶转基因株系的无机磷含量都显著高于野生型。特别是低磷条件下appA转基因株系要显著高于野生型。据此说明，本发明的appA转基因水稻在农业生产和科学研究上具有一定的价值。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是转基因载体的构建图；A代表邻p力基因在双元载体中的表达盒，B代表.双元表达载体pCAMBIA1301载体图，C代表双元表达载体p35S-appA的载体图2是appA转基因植株在水培条件下不同供磷处理时的植株含磷量对比图；此植株苗龄为14天，+和1朋处理加入了10ppm的磷酸氢钠和植酸，折合磷含量为10ppm;星号表示同一处理内样品间存在着显著差异(PO.05,LSDtest);图3是appA转基因植株在不同供磷处理时的相对含磷量对比图；IHP处理用的是缺磷土中拌入每千克土0.447克的植酸，折合磷含量为10ppm;相对含磷量为处理时的磷含量占正常供磷时植株含水量磷量的比值；星号表示同一处理内样品间存在着显著差异(P<0.05,LSDtest)。图4是appA转基因植株的RT-PCR检测结果图；APPA、和ACTIN分别表示邻-、和Osv4cri"基因的RT-PCR扩增结果。具体实施例方式实施例l、构建含有SEQIDNO:l的植物表达载体以花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)为启动子，使目的基因组成性表达；引入来自胡萝卜的外展蛋白extensin(GenBankaccessionnumber:X02873)，这是一个外分泌的信号肽，能够引导蛋白向胞外分泌，其序列见SEQIDNO:3;邻!pj(GenBankaccessionnumber:AF537219)克隆自大肠杆菌(&cAm'c/^co/z')，其具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，已去除其原有的信号肽序列；以ocs为终止子。表达盒见图1。将该表达盒连接到pCAMBIA1301。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌"gro6a"eWM附&we/flc/era)株系EHA105中。具体步骤如下1)、从实验室已有载体p1300改上用五coRI和Sad这两个酶切位点将CaMV35S切下，连入pCAMBIA1301载体中，转化DH5a，挑选阳性克隆，为pl301-35S。2)、设计引物如下Ex-U-Kpnl:5'CGAGGTACCATGGGAAGAATTGCTAG3'Ex-L-BamHI:5'CTAGGATCCAGCTGTGGTTTCGGAAG3，用这对引物，以pAER02(由澳洲CSIRO的Richardson惠赠)为模板进行扩增，将PCR扩增产物用i^"I和&mHI酶切，并连入pl301-35S中，转化DH5a，挑选阳性克隆，为p醒-35S-Ex。3)、设计引物如下AppA-U-BamHI:5'ATAGGATCCCAGAGTGAGCCGGAG3，(去除信号肽序列)AppA-L-PstI:5，TTACTGCAGATTACAAACTGCACGCC3，用这对引物，以大肠杆菌DNA为模板进行扩增，将PCR扩增产物用Bamffl和PWl酶切，并连入pl301-35S-Ex中，转化DH5a，挑选阳性克隆，为pl301-35S-Ex-appA。4)从实验室已有载体p1300改上用尸WI和//z^dlll这两个酶切位点将ocs终止子切下，连入中，转化DH5a，挑选阳性克隆，为pl301-35S-Ex-appA-ocs简称p35S-appA。实施例2、植物转化具体步骤如下一、水稻愈伤组织的诱导1.消毒取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒:1)将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；2)倒去酒精，加入100ml20。/。次氯酸钠(NaClO)溶液，浸泡30分钟；3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。2.诱导与继代培养(以下步骤需无菌操作)1)种子放在无菌滤纸上吸干，置入成熟胚诱导培养基中，每皿12—14颗；2)操作完毕用封口膜(MicroporeTMSurgicalTape)封好培养皿，在28'C光照培养箱，培养3周；3)在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中，在28i:光照培养箱，继代培养1周。二、共培养和抗性愈伤组织的选择1.感菌与共培养1)农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液于4mlYEP(含50mg/lKan和50mg/lStr)培养液中，28°C，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD,为0.8-1.0。2)取培养好的菌液500W于1.5ml离心管中，4°C，4000rmp，离心2min，去上清。用含200Pmol/lAs的30mlAAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD6GG的终浓度为0.01-0.1;3)将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；4)将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；5)将愈伤组织置于共培养基上。25""C暗培养2.5天。2.选择1)愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定的无菌水清洗12遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；2)将晾干的愈伤转入含500mg/l头孢拉定和50mg/l潮霉素(HygromycinB)的选择培养基上进行第一轮选择，28°C，光照培养14天；3)将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l头孢拉定和80mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28°C，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。三、抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中(每皿或每瓶放置5-7颗)，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)。待苗长至lcm左右，放入生根培养基中壮苗。四、转基因苗的锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:11cagagtgagccggagctgsagctggasagtgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtgcgt61gctccaaccasggccscgcaactgatgcaggatgtcaccccag3cgca±ggccsacctgg121ccggtaaaactgggttggctgacaccgcgcggtggtgsgctaatcgcctatctcggacat181taccaacgccagcgtctggtagccgacggattgctggcgaaasagggctgcccgcagtct241ggtcsggtcgcgattattgctgatgtcgacgsgcgtacccgtsaaacaggcgaagccttc301gccgccgggctggcacctgactgtgc33tscccsggcsgstacgtccagt361cccgatccgttstttwtccggcgtttgcccgcgaacgtg421actgacgcgatcctcagcagggcaggagggtcaattgctgactttaccgggcatcggcaa481acggcgtttcgcgaactggaacgggtgctt33ttttccgcgtgccttaaa5413ggsicgaaagctgttcattaacgcaggcatt3cc3tcggatatctcaaggtg601agcgccgacaatgtctcattasccggtgcggtasgcctcgcatcaatgct661tttctcctgcgggaatgccggsgccggggtggggssggstcaccgattca721caecagtggaacaccttgctaagtttgcattttatttgttacaacgcacg781ccag3ggttgcccgcagccgcgccaccccgtt3ttsg3tttgaLtc33gscagcgttgacg841CCCC3tCC3Cggcgtatggtgtgacattaicccacttcagtgctgtttatc901gccggscscg3t3Ct33tctggcaaatctcggcggcgcactgg3gctc33ctggacgctt961cccggtcagccggataacacgccgccaggtggtgaactggtgtttgsscgctggcgtcgg1021ctaagcgata3C3gccagtggstttcaggtttcgctggtcttcc3gactttacagcagatg1081cgtgataaaacgccgctgtcccgcccggaggaccctggca1141gg3tgtg33gagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcssiatcgtg1201aatgaagcaicgcatsccggcgtgcagtttgt33SEQIDNO:21GlnGluProGluLeuLysLeuGluSerValVallieValSer16ArgHisGlyValArgAlaProThrLysAlaThrGinLeuMETGin31AspValThrProAspAlaTrpProThrTrpProValLyslieuGly46TrpLeuThrProArgGlyGlyGlu!LeulieAlaTyrLeuGlyHis61TyrGinArgGinArgLeuValAlaAspGlyLeuLeuAlaLysLys76GlyCysProGinSerGlyGinValAlalielieAlaAspValAsp91GluArgThrArgLysThrGlyGluAlaPheAlaAlaGlyLeuAla106ProAspCysAlalieThrValHisThrGinAlaAspThrSerSer121ProAspProLeuPheAsnProLeuLysThrGlyValCysGinLeu136AspAsnAlaAsnValThrAspAlalieLeuSerArgAlaGlyGly151SerlieAlaAspPheThrGlyHisArgGinThrAlaPheArgGlu166LeuGluArgValILeuAsnPheProGinSerAsnLeuCysLeuIiys181ArgGluLysGinAspGluSerCysSerLeuThrGinAlaLeuPro196SerGluLeuLysValSerAlaAspAsnValSerLeuThrGlyAla211ValSerLeuAlaSerMETlieuThrIiysliePheLeuLeuGinGin226AlaGinGlyMETProGluProGlyTrpGlyArglieThrAspSer241HisGinTrpAsnThrIjeuLeuSerLeuHisAsnAlaGinPheTyr256LeuLeuGinArgThrProGluValAlaArgSerArgAlaThrPro271Leu3LeuAsplieulieLysThrAlalieuThrProHisProProGlu286IiysGinAlaTyrGlyValThrLeuProThrSerValLeuPhelie301AlaGlyHisAspThrAsnLeuAlaAsnlieuGlyGlyAlaLeuGlu316LeuAsnTrpThrLeuProGlyGinProAspAsnThrProProGly331GlyGluLeuValPheGluArgTrpArgArgLeuSerAspAsnSer346GinTrplieGinValSerlieuValPheGinThrLeuGinGinMET361ArgAsp!LysThrProLeuSerLeuAsnThrProProGlyGluVal376LysLeuThrLeuAlaGlyCysGluGluArgAsnAlaGinGlyMET391CysSer!LeuAlaGlyPheThrGinlieValAsnGluAlaArglie406ProAlaCysSerLeuSEQIDNO:31atgggsagaattgctagaggctcaaaaatgagttctctcattgtgtctttgcttgtagta61ttggtgtcactcaatttggcttccgaaaccacagct权利要求1、一种大肠杆菌基因appA在培育转基因作物中的应用，其特征是用于培育土壤有机磷利用型转基因作物。2、一种土壤有机磷利用型转基因作物的培育方法，其特征是包括以下步骤1)、选用大肠杆菌基因邻P^，该基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；2)、选用胡萝卜外展蛋白的信号肽，该信号肽具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；3)、外分泌型植酸酶转基因载体的构建将花椰菜花叶病毒35S启动子、胡萝卜外展蛋白的信号肽、大肠杆菌基因邻p4与根癌农杆菌章鱼碱合成酶基因终止子Tocs正向串联连接，获得过量表达外分泌型邻pA基因的表达框，从而获得转基因载体p35S-appA;4)、将所述转基因载体p35S-appA导入农作物中，从而获得转基因作物。3、根据权利要求2所述的土壤有机磷利用型转基因作物的培育方法，其特征是所述农作物为水稻。全文摘要本发明公开了一种大肠杆菌基因appA在培育转基因作物中的应用用于培育土壤有机磷利用型转基因作物。本发明还同时公开了上述转基因作物的培育方法，包括以下步骤1)选用大肠杆菌基因appA；2)选用胡萝卜外展蛋白的信号肽；3)外分泌型植酸酶转基因载体的构建，从而获得转基因载体p35S-appA；4)将转基因载体p35S-appA导入农作物中，从而获得转基因作物。采用本发明方法所得的appA转基因水稻，能充分吸收利用土壤中的植酸，且能降低籽粒内的植酸含量。文档编号A01H1/00GK101392264SQ20081006060公开日2009年3月25日申请日期2008年4月10日优先权日2008年4月10日发明者何晓薇,洁周,寿惠霞,珊应,谦张,晔郑,峰高申请人:浙江大学