一种抗生素生物农药及其制备方法

专利名称：：一种抗生素生物农药及其制备方法
技术领域：
：:本发明涉及一种抗生素生物农药及其制备方法，属于微生物发酵工程
技术领域：
。病虫害每年给农业生产造成巨大损失，为了实现稳产高产，人们一直主要采用化学农药给予控制。化学农药具有防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、成本低、使用简单等优点，因而得到了迅速发展，并成为防治病虫害夺取农业生产丰收的一个重要手段。据统计，我国近些年化学农药防治面积占总防治面积的比率高达95%左右。由于化学农药的长期、大量和反复使用，带来了对土壤、水体和大气的污染；农副产品中农药残留增加，也直接危害了人类健康；同时，害虫和病菌的抗药性不断加深和扩大，全世界至少已有500多种害虫对农药产生了抗性，有的害虫抗性高达几万倍；此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益生物，破坏了生态平衡，引起害虫更加猖獗。这样，不得不加大农药的施用量和频度，从而造成化学农药应用的恶性循环。我国是属于人地关系非常紧张的地区，其出路在于大力发展生物农药。本发明的目的是要克服现有技术缺陷，提供一种新的生物农药，代替现有化学农药用于防治红蜘蛛、蚜虫、菜青虫等作物害虫。为实现上述目的采取的技术方案本发明的生物农药，其活性有效成份为农抗HA97502,分子式为C25H3704N，化学结构式其制备采用阿布拉链霉菌HA97502(5Yr印tcM^cesaZwraw'e/wisHA97502)为产生菌，通过微生物发酵培养技术生产。
背景技术：
：:发明目的:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>本发明的具体内容1.产生菌鉴定(1)形态特征菌株HA97502革兰氏染色阳性；在高氏合成1号琼脂和燕麦琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂，多分枝；气生菌丝生长丰富，分化形成孢子丝；孢子丝直至柔曲，孢子椭圆形，表面光滑。(2)培养特征菌株HA97502的培养特征见说明书附表1:(3)细胞壁类型分析菌株HA97502的全细胞水解液含有L,L-DAP(L，L-二氨基庚二酸Diamin叩imelicacid)，无特征性糖；细胞壁属于I型，糖型C。(4)生理生化特征菌株的生理生化特征见说明书附表2。(5)16SrDNA序列分析菌株HA97502的16SrDNA序列见序列表与GenBank中相关序列Blast比较的结果表明，该菌株属于链霉菌属；与目前发表的相关菌株相比，菌株HA97502与阿布拉链霉菌(5Yr印to/sycesa6"raw'e/7sis)的16SrDNA序列一致，同源性为100%。根据形态特征、细胞壁组分和16SrDNA序列分析，菌株HA97502属于链霉菌属；其形态特征、16SrDNA序列和生理生化特征均与阿布拉链霉菌高度相似。故将菌株HA97502鉴定为阿布拉链霉菌(5"tre/t。早ce51a6"raw.e/57.51)。2.有效成份鉴定(1)有效成份的提取分离发酵液经过滤、溶剂提取、硅胶柱层析分离及高效液相色谱纯化即得纯品。具体流程见说明书附图1。(2)有效成份的结构论证农抗HA97502的紫外有三个吸收峰，Amax(inMeOH)为233、238和267咖，与杀粉蝶菌素A相似。农抗HA97502的氢核磁共振谱('HNMR)，基本骨架的杂环及直链部分与杀粉蝶菌素Ai—致，其区别主要在于支链甲基部分。农抗HA97502的力醒R谱有二个CH3质子吸收峰的化学位移完全相同，均在1.74ppm处，且均为单峰，说明这二个CH3与同一个烯碳相连，具体结构见下图。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>3.制备工艺-(l)生产菌种本发明所用的微生物菌种为阿布拉链霉菌HA97502(5Yre/^o/z^cesa^raw'e/sisHA97502),保藏于CGMCC(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，保藏号CGMCCN0.2297,保藏日期为2007年12月14日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路。(2)培养基①种子斜面培养基■30.1%、K2HP040.05%、MgS040.05%、NaCI0.05%、可溶性淀粉2.0%、琼脂2.0%、蛋白胨O.1%，pH7.2~7.4。②发酵培养基培养基中的营养源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可为玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、饴糖等；氮源可为玉米浆、尿素、蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉等。在此基础上再添加一些其它营养成份，如食盐、磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐等。(3)培养条件培养温度为22-34°c，培养ph值为4-10，培养时间为30~124小时。(4)产品后处理培养液经离心或过滤得菌体，菌体用溶剂提取后浓縮，或进一步进行硅胶柱层析等分离后，即可配制成所需含量的农药制剂产品。具体工艺流程见说明书附图2。本发明的显著优点1.广谱田间药效实验表明，农抗HA97502对红蜘蛛、蚜虫、菜青虫等多种作物害虫具有良好防治效果(80%以上)。2.髙效室内毒力测定表明，农抗HA97502在低浓度下即对多种作物害虫具有毒杀作用，测定结果为柑桔红蜘蛛LC5。2.3385ppm，瓜顿LC5。1.6819ppm，桃岈LC5。2.4222ppm,菜青虫LCso5.0556ppm。3.价廉发酵培养基主要成分均为普通农副产品，发酵周期也比较短，因而生产成本比较低。-图1为本发明的纯品分离流程图；图2为本发明的产品制备工艺流程图。具体实施例方式本发明有以下实施例实施例一农抗HA975021%制剂的制备在5吨发酵罐中，按甘薯淀粉3%、玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、尿素0.5%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.5%、碳酸钙0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%的配比配成3.5吨培养基(pH7.2~7.4)。按常规方法灭菌后冷却至28°C，接种农抗HA97502产生菌，经28'C通气培养58小时即得效价约1500ug/ml的发酵液。该发酵液经板框压滤，菌体用1.5倍发酵液体积的95%工业酒精浸提三次，浸提液经真空浓缩除去酒精，稀释至效价10000-11500ug/ml后，分装即为1%制剂产品。实施例二农抗HA97502防治茄红蜘蛛(1)供试药剂和浓度供试药剂为1%农抗HA97502制剂500倍、650倍、800倍稀释液，对照药剂为20%双甲脒乳油1000倍稀释液，空白对照为清水。(2)试验方法试验作物为茄子，试验面积为666.7m2，共4个处理，重复3次，随机区组排列。采用山东产"卫士"背负式手动喷雾器，用量按每666.7ir^45Kg药液量进行全株均匀喷雾。喷药前随机选择3点，每点选择5株作为定点调查株，每株定点调查顶部5张叶片活虫数。喷药后24、48、72小时调査残存活虫数，计算虫口减退率和校正防效。虫口减退率(％)=[(施药前活虫数一施药后活虫数)/施药前活虫数]x100校正防效(％)=[(处理区虫口减退率-对照区虫口减退率)/(100-对照区虫口减退率)]x100(3)试验结果由下表可以看出，1%农抗HA97502制剂500倍稀释液对茄红蜘蛛有很好的防效，喷药后24小时即发生作用，72小时防效为93.4%，优于20%双甲脒乳油1000倍稀释液(90.2%)。1%农抗HA97502制剂650倍、800倍稀释液对茄红蜘蛛的72小时防效分别为85.1%、75.9%。农抗HA97502防治茄红蜘蛛田间药效处理组药前活虫数(头)药后24小时药后48小时药后72小时活虫数(头)减退率(％)防效(%)活虫数(头)减退率(％)防效(%)活虫数(头)减退率(o/o)防效(%)HA97502500x84814283.383.812085.887.06192.893.4磨502650x83525569.570.422573.175.413783.685.1HA97502800x94443753.755.138759.062.524973.675.9双甲脒lOOOx8715481.181.710187.688.78889.2卯.2清水792817-3.2/866-9.4/869-9.7/实施例三农抗HA97502防治菜青虫(1)供试药剂和浓度供试药剂为1%农抗HA97502制剂500倍、650倍、800倍稀释液，对照药剂为2.5%溴氰菊酯乳油2500倍稀释液，空白对照为清水。(2)试^方法试验作物为甘蓝，试验面积为666.7m2，共4个处理，重复3次，随机区组排列。采用山东产"卫士"背负式手动喷雾器，用量按每666.7m245Kg药液量进行全株均匀喷雾。调查采用对角线5点取样法，每点2株，每小区调查10株。喷药前调查虫口基数，喷药后1天、2天、5天调查残存活虫数，计算虫口减退率和校正防效，计算方法同实施例二。(3)试验结果农抗HA97502防治菜青虫田间药效<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上表可以看出，1%农抗HA97502制剂500倍液对菜青虫5天后防效为85.1%，与2.5%溴氰菊酯乳油2500倍稀释液相近。附表l菌株HA97502的培养特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>附表2菌株HA97502的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>GGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTMG1020TCCCGCMCGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGA1080CTCACAGGAGACTGCCGGGGTCMCTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATG1120CCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCG1180CGAGGCGGAGCGMTCCCAAMAGCCGGCCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACC1240CCATGMGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGG1300GCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTA1360ACCCGTAAGGGGAGGAGCCGTCGMGGTGCGG139权利要求1.一种抗生素生物农药，其特征是有效成份为农抗HA97502，分子式为C25H37O4N，化学结构式为id="icf0001"file="S2008100608083C00011.gif"wi="168"he="29"top="55"left="23"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.权利要求1所述抗生素生物农药的制备方法，采用微生物发酵技术生产，其特征是产生菌为阿布拉链霉菌^repto历ycesatoraWe/sj'sHA97502,菌种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.2297。全文摘要本发明涉及一种抗生素生物农药，该生物农药的制备方法及应用。其特征是该生物农药的活性成分为农抗HA97502，分子式为C₂₅H₃₇O₄N，化学结构式为该生物农药的制备采用微生物发酵技术，生产菌种为阿布拉链霉菌HA97502(StreptomycesaburaviensisHA97502)；它是一种农用杀虫剂，对农业生产上的重要害虫红蜘蛛、蚜虫、菜青虫等有特效。文档编号A01N43/34GK101300980SQ200810060808公开日2008年11月12日申请日期2008年3月21日优先权日2008年3月21日发明者吴吉安,施跃峰,桑金隆,梁建根,竺利红申请人:浙江省农业科学院