专利名称：高粱的高频再生方法
技术领域：
本发明一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本发明涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor(L. )Moench，通过器官发生获得高频再生。本文引用以说明本发明背景的公开文献和其它材料，以及尤其是提供关于实施的 附加细节的实例，在此一并引入作为参考，为了方便起见，在下文通过作者、日期引用并且 在所附参考文献中按照作者字母顺序排列。高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)是一种广泛种植的谷类和饲料作物，更紧密 地与原产热带的主要作物相联系，比如大米、玉米、甘蔗和黑黍。高粱在谷类作物产量中居 第五，是热带禾本科植物的重要模型。由于能非常好地适应极端环境，特别是干旱和高温， 因此在主要谷类中是独特的。这些特性使得高粱成为在极端高温和极少降水的地区养活人 类和动物种群的合适的谷物(Howe等2006)。另外，目前国际对经济、环境和能源安全的关 注促使从矿物燃料向生物燃料替代品转变，比如生物乙醇和生物柴油。由于生物燃料能从 多种作物产生，每个国家采取策略开发所拥有作物的比较优势。不同生物燃料作物中，高粱由于其生理和天然因素(包括其事实是光合高效的C4 植物)，被认为是生产生物乙醇更好的选择。可以利用诸如组织培养和转化的生物技术进一 步改良该作物。30多年中，一些报道记录了使用各种外植体使用不同培养基组合物的高粱 再生。这些报道包括高粱植株再生(未成熟胚(Gamborg等1977，Ma等1987,Hagio 2002), 成熟胚的茎叶(shoot)部(Cai等1987)，苗端(Zhong等1988)，成熟胚(Nirwan和Kothari 2003)，根部横向薄层细胞(Baskaran等2006))，体细胞胚发生(未成熟和成熟胚(Rao等 1995,Elkonin 等 1996,MacKinnon 等 1986)，叶基(Mishra和 Khurana 2003))及其转化(未 成熟胚(Zhao等2000，Carvalho等2004)，未成熟和成熟胚，茎尖和胚性愈伤组织(Tadesse 等 2003)和苗端(Giriiashankar 等 2005)，种子(Howe 等 2006))。尽管有这些成功的报道，但是还需要开发用于高粱的新技术。这种技术必须具有 高频再生，其有助于该技术应用于诸如增加生物量或提高糖含量的遗传学操作，以改善该 作物的生物乙醇产量。
发明内容
本发明一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本发明涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor (L. )Moench，通过器官发生获得高频再生。因此，本发明首次提出一种甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的再生方法。 简言之，使用切开的具胚子叶(DEC)外植体通过器官发生再生高粱。本发明广泛应用于 甜高粱变种和杂种，此处特别说明是关于甜高粱(Sorghum bicolor (L.)Moench)杂交品种 Liotian ULioza 7050A和LiaoJi Za 1。除了提供高频再生之外，本发明还可直接应用于 通过体细胞无性系变异生产高粱变异体和可直接应用于高粱的遗传学转化。根据本发明，从中国甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的切开的具胚子叶 (DEC)外植体诱导器官性愈伤组织，并从该器官性愈伤组织再生植株。本发明的高频再生系统由六阶段组成阶段1 (愈伤组织诱导)，阶段2和3 (茎叶芽(shoot bud)诱导和减少 酚渗出液)，阶段4 (诱导茎叶芽萌发和伸长)，阶段5 (茎叶伸长和减少酚渗出)以及阶段 6 (生根)。阶段1中MS矿物盐添加N6维生素，在后续阶段MS矿物盐添加B5维生素，并且 在特定阶段改变抗氧化剂(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP))、 有机添加剂(例如硫酸腺嘌呤(AdSO4))、无机添加剂(例如AgNO3)、氨基酸(例如L-脯氨 酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸)和PGRs (植物生长调节剂)，提高了再生效率并减少高粱组织 培养中固有的高酚化合物渗出。短短三个月内从DEC外植体产生无基因型显著变异的大约 250-300株健康小植株，存活率为100%。
图1A-1I示出了依照本发明通过切开的具胚子叶(DEC)的器官发生实现的高粱再 生。图IA和IB示出了子叶节内和周围没有生根和愈伤组织诱导的切开的具胚子叶外植体。 图IC示出了从DEC愈伤组织诱导的茎叶芽。图ID和IE示出了从茎叶芽再生的多个茎叶。图IF示出了再生茎叶的伸长。图G和H出示了伸长的茎叶的生根。图II示出了已炼苗的小植株。
具体实施例方式本发明一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本发明涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicoloHDMoench，通过器官发生获得高频再生。除了提供高频再 生之外，本发明还可直接应用于通过体细胞无性系变异生产高粱变异体和可直接应用于高 粱的遗传学转化。说明书下文，仅仅出于方便考虑，通过参考某些高粱杂种来描述发明各方面。用其 它高粱变种和杂种代替提到的高粱杂种是可以理解的。此处提到的“器官发生”是指通过愈伤组织或植物任意部位的直接分生组织在可 控环境条件下在特定培养基内再生茎叶。此处提到的“愈伤组织”是指从任意外植体组织产生的无器官或未分化的增殖细 胞块。根据本发明，提供了一种通过器官发生再生高粱的方法，其有效地获得高频的再 生植物。一个实施方案中，从获得自高粱，尤其是Sorghum bicoloHDMoench的具胚子叶 外植体再生植物。将具胚子叶的外植体切开并放入固体培养基中，在此指阶段1的培养基。 在一个实施方案中，阶段1培养基包括MS矿物盐和N6维生素并添加L-脯氨酸和L-谷氨酰 胺。在一个实施方案中，阶段1培养基中添加大约25mg至大约200mgL-脯氨酸，优选大约 50mg至大约IOOmg L-脯氨酸，更优选大约IOOmg L-脯氨酸。另一实施方案中，阶段1培养 基中添加大约50mg至大约250mg L-谷氨酰胺，优选大约50mg至大约IOOmg L-谷氨酰胺， 更优选大约IOOmg L-谷氨酰胺。阶段1培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施方案 中，植物生长调节剂是生长素和脱落酸(ABA)。优选实施方案中，生长素是二氯苯氧基乙酸 (2，4-D)。一个实施方案中，阶段1培养基中ABA浓度是大约0. 94 μ M至大约18. 9 μ Μ，优选 大约0. 94 μ M至大约7. 56 μ Μ,更优选大约3. 78 μ Μ。另一实施方案中，阶段1培养基中2， 4-D浓度是大约2. 26 μ M至大约9. 04 μ Μ,优选大约4. 52 μ M至大约6. 78 μ Μ,更优选大约6. 78 μ M0阶段1培养基还包括碳源。在一个实施方案中，碳源是大约2%至大约5%，优选 大约2 %至大约3 %，更优选大约3 %的蔗糖。另一实施方案中，碳源是大约2 %至大约5 %， 优选大约3 %至大约5 %的葡萄糖。另一实施方案中，碳源是大约2 %至大约5 %，优选大约 2%至大约3%的果糖。又一实施方案中，碳源是大约2%至大约5%，优选大约2%至大约 3%的麦芽糖。另一实施方案中，碳源是蔗糖和葡萄糖混合物，蔗糖大约2%至大约3%，优 选大约2%，葡萄糖大约2%至大约3%，优选大约2%。再一实施方案中，碳源是果糖和葡 萄糖混合物，果糖大约1 %至大约2 %，优选大约1 %，葡萄糖大约2 %至大约3 %，优选大约 2%。又一实施方案中，碳源是麦芽糖和葡萄糖混合物，麦芽糖大约至大约2%，优选大 约1 %，葡萄糖大约2 %至大约3 %，优选大约2 %。一个实施方案中，DEC片段在阶段1培养基中培养大约4-8周，优选大约6周。另 一实施方案中，阶段1培养物以大约2周的周期继代培养。一个实施方案中，阶段1培养保 持大约25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相对湿度。一个实施方案中， 光周期是在大约25 μ EnT2s-1光密度的白色荧光下进行。阶段1培养基中培养的无根的DEC 片段显示受抑制的生长，但是同时外植体膨胀，粗而短，变成黄绿色。与子叶相连的胚芽在 子叶节内或周围凸起形成愈伤组织(SCPC)。阶段1培养基中ABA、脯氨酸和L-谷氨酰胺诱 导胁迫并抑制与子叶相连的胚芽的发芽。2，4-D诱导愈伤组织形成。随同胚芽一起，根组织 也在2周内开始凸出。将这些根组织从外植体全部除去。在阶段1培养基培养后，损伤SCPC，放入被称为阶段2培养基的固体培养基中。在 一个实施方案中，阶段2培养基包括MS矿物盐和B5维生素并且添加L-脯氨酸、L-谷氨酰 胺、L-甘氨酸、抗坏血酸(Asc)、AgN03、PVP和PVPP。在一个实施方案中，阶段2培养基中添 加大约IOOmg至大约IOOOmg L-脯氨酸，优选大约300mg至大约600mg L-脯氨酸，更优选 大约500mg L-脯氨酸。另一实施方案中，阶段2培养基中添加大约IOOmg至大约IOOOmg L-谷氨酰胺，优选大约300mg至大约600mg L-谷氨酰胺，更优选大约500mg L-谷氨酰胺。 再一实施方案中，阶段2培养基添加大约1. 42 μ M至大约11. 36 μ Μ，优选大约2. 84 μ M至 大约8. 52 μ Μ,更优选大约5. 67 μ M浓度的Asc。在一个实施方案中，阶段2培养基添加大 约0. 25g至大约1. 5g，优选大约0. 5g至大约1. 5g，更优选大约1. Og的PVP。另一实施方 案中，阶段2培养基添加大约0. 25g至大约1. 5g，优选大约0. 5g至大约1. Og,更优选大约 1. Og的PVPP。再一实施方案中，阶段2培养基中添加大约2mg至大约20mg L-甘氨酸，优 选大约5mg至大约15mg L-甘氨酸，更优选大约IOmg L-甘氨酸。又一实施方案中，阶段2 培养基添加大约0. 2mg至大约1. 5mg,优选大约0. 5mg至大约1. Omg,更优选大约1. Omg的 AgNO30阶段2培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施方案中，植物生长调节剂是生长 素。优选实施方案中，生长素是2，4-D。在一个实施方案中，阶段2培养基中2，4-D浓度是 大约2. 26 μ M至大约9. 04 μ Μ,优选大约4. 52 μ M至大约6. 78 μ Μ,更优选大约6. 78 μ Μ。阶 段2培养基还包括碳源。阶段2培养基中的碳源可与阶段1培养基中相同。优选实施方案 中，碳源是大约2%至大约5%，优选大约2%至大约3%，更优选大约3%的蔗糖。一个实施方案中，受损的SCPC在阶段2培养基中培养大约3-7天，优选大约5天。 另一实施方案中，阶段2培养保持在前面所述的大约25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期， 55%至60%的相对湿度。在这期间，茎叶芽开始从胚芽愈伤组织和子叶节内和周围诱导出。 同时，大量酚渗出液开始从茎叶芽基部渗出。阶段2培养基中添加Asc、PVP、PVPP、L-甘氨酸和AgNO3阻止这些酚渗出液的渗出。阶段2培养基中SCPC超过5天的长时间培养抑制 茎叶芽发育，同时茎叶芽变褐色，最终衰老。在阶段2培养基培养后，组织放入被称为阶段3培养基的固体培养基中。在一个 实施方案中，阶段3培养基包括MS矿物盐和B5维生素并且添加L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、 干酪素水解物(CH)、硫酸腺嘌呤(AdSO4)和PVP。在一个实施方案中，阶段3培养基中添加 大约IOOmg至大约lOOOmg，优选大约300mg至大约600mg，更优选大约500mg L-谷氨酰胺。 另一实施方案中，阶段3培养基中添加大约5mg至大约25mg，优选大约IOmg至大约20mg， 更优选大约20mg L-甘氨酸。再一实施方案中，阶段3培养基添加大约0. 25g至大约1.5g， 优选大约0. 5g至大约1. 5g，更优选大约1. Og的PVP。在一个实施方案中，阶段3培养基添 加大约0. 5g至大约1. 5g，优选大约0. 5g至大约1. Og,更优选大约1. Og的CH。另一实施方 案中，阶段3培养基中添加大约25mg至大约200mg，优选大约50mg至大约lOOmg，更优选大 约IOOmg的AdS04。阶段3培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施方案中，植物生长调 节剂是生长素和细胞分裂素。优选实施方案中，生长素是2，4-D。在一个实施方案中，阶段 3培养基中2，4-D浓度是大约0. 56 μ M至大约2. 24 μ Μ，优选大约0. 56 μ M至大约1. 12μΜ， 更优选大约1. 12 μ Μ。优选实施方案中，细胞分裂素是6-苄基氨基嘌呤(BA)和激动素(KN) 的混合物。在一个实施方案中，阶段3培养基中BA浓度是大约4. 43 μ M至大约13. 29 μ Μ, 优选大约4. 43 μ M至大约11. 07 μ Μ，更优选大约8. 86 μ Μ。另一实施方案中，阶段3培养基 中KN浓度是大约2. 32 μ M至大约18. 56 μ Μ,优选大约4. 64 μ M至大约13. 92 μ Μ,更优选大 约9.28 μ Μ。阶段3培养基还包括碳源。阶段3培养基中的碳源可与阶段1培养基中相同。 优选实施方案中，碳源是大约2 %至大约5 %，优选大约2 %至大约3 %，更优选大约3 %的蔗 糖。一个实施方案中，组织在阶段3培养基中培养大约7-15天，优选大约10天。另一 实施方案中，阶段3培养物以大约5天的周期继代培养。一个实施方案中，阶段3培养保持 在前面所述的大约25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相对湿度。阶段3 培养基中，降低生长素(2，4-D)浓度，添加细胞分裂素(BA，KN)和有机添加剂(如CH、AdS04、 PVP)以提高茎叶芽增殖和生长。在阶段3培养基培养后，从一簇茎叶芽分成每簇有3-5个芽的8-10簇增殖茎叶 芽，放入被称为阶段4培养基的固体培养基中培养。在一个实施方案中，阶段4培养基包括 MS矿物盐和B5维生素并且添加L-甘氨酸和硫酸腺嘌呤(AdS04)。在一个实施方案中，阶段 4培养基中添加大约5mg至大约25mg，优选大约IOmg至大约20mg，更优选大约20mg L-甘 氨酸。另一实施方案中，阶段4培养基中添加大约25mg至大约200mg，优选大约50mg至大 约lOOmg，更优选大约IOOmg的AdS04。阶段4培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施 方案中，植物生长调节剂是细胞分裂素和赤霉酸(GA3)。优选实施方案中，细胞分裂素是BA。 在一个实施方案中，阶段4培养基中BA浓度是大约4. 43 μ M至大约13. 29 μ Μ,优选大约 4. 43 μ M至大约11. 07 μ Μ，更优选大约8. 86 μ Μ。另一实施方案中，阶段4培养基中GA3浓度 是大约0. 72 μ M至大约2. 88 μ Μ,优选大约0. 72 μ M至大约2. 16 μ Μ,更优选大约1. 44 μ Μ。 阶段4培养基还包括碳源。阶段4培养基中的碳源可与阶段1培养基中相同。优选实施方 案中，碳源是大约2%至大约5%，优选大约2%至大约3%，更优选大约3%的蔗糖。一个实施方案中，增殖茎叶芽在阶段4培养基中培养大约1-3周，优选大约2周。
9另一实施方案中，阶段4培养物以一周的周期继代培养。一个实施方案中，阶段4培养保 持在前面所述的大约25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相对湿度。2周 后大约25-30个具有再生茎叶的茎叶芽从每单簇中长出。在阶段4中除去植物生长调节 剂(PRGs) (2,4-D和KN)和无机添加剂(PVP、CH和L-谷氨酰胺)并添加GA3以使得茎叶伸 长。当茎叶芽从簇中分开时组织会损伤，这些损伤产生酚类分泌物，以至于组织基部变为褐
里任在阶段4培养基培养后，增殖茎叶芽放入被称为阶段5培养基的固体培养基中培 养。在一个实施方案中，阶段5培养基包括MS矿物盐和B5维生素并且添加L-甘氨酸、PVP 和硫酸腺嘌呤(AdS04)。在一个实施方案中，阶段5培养基中添加大约5mg至大约25mg，优 选大约IOmg至大约20mg，更优选大约20mg L-甘氨酸。另一实施方案中，阶段5培养基中 添加大约25mg至大约200mg，优选大约50mg至大约lOOmg，更优选大约IOOmg的AdSO4。再 一实施方案中，阶段5培养基添加大约0. 5g至大约1. 5g，优选大约0. 5g至大约1. Og,更优 选大约l.Og的PVP。阶段5培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施方案中，植物生长 调节剂是细胞分裂素和赤霉酸(GA3)。优选实施方案中，细胞分裂素是ΒΑ。在一个实施方 案中，阶段5培养基中BA浓度是大约4. 43 μ M至大约13. 29 μ Μ，优选大约4. 43 μ M至大约 11. 07 μ Μ,更优选大约8. 86 μ Μ。另一实施方案中，阶段5培养基中GA3浓度是大约0. 72 μ M 至大约2. 88 μ Μ,优选大约0. 72 μ M至大约2. 16 μ Μ,更优选大约1. 44 μ Μ。阶段5培养基还 包括碳源。阶段5培养基中的碳源可与阶段1培养基中相同。优选实施方案中，碳源是大 约2 %至大约5 %，优选大约2 %至大约3 %，更优选大约3 %的蔗糖。一个实施方案中，增殖中的茎叶芽在阶段5培养基中培养大约1-3周，优选大约2 周。另一实施方案中，阶段5培养物以大约1周的周期继代培养。一个实施方案中，阶段5 培养维持在前面所述的大约25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相对湿度。 为避免组织进一步褐变，在阶段5培养基中添加PVP作为抗氧化剂。PVP不抑制茎叶生长， 但是能提高茎叶增殖。在阶段5培养基中，茎叶增殖和生长在2周内达到最大(4cm)。在阶段5培养基培养后，将长有2-3个大约4cm高的茎叶的茎叶簇转入用于生根 的被称为阶段6培养基的固体培养基中培养。在一个实施方案中，阶段6培养基包括MS矿 物盐和B5维生素并且添加L-甘氨酸、PVP和硫酸腺嘌呤(AdSO4)。在一个实施方案中，阶段 6培养基中添加大约5mg至大约25mg，优选大约IOmg至大约20mg，更优选大约20mg L-甘 氨酸。另一实施方案中，阶段6培养基中添加大约25mg至大约200mg，优选大约50mg至大 约lOOmg，更优选大约IOOmg的AdSO4。再一实施方案中，阶段6培养基添加大约0. 5g至大 约1. 5g，优选大约0. 5g至大约1. Og,更优选大约1. Og的PVP。阶段6培养基还包括植物 生长调节剂。在一个实施方案中，植物生长调节剂是生长素。优选实施方案中，生长素是吲 哚-3-乙酸(IAA)。在一个实施方案中，阶段6培养基中IAA浓度是大约2. 85 μ M至大约 11. 4 μ Μ，优选大约2. 85 μ M至大约8. 55 μ Μ,更优选大约5. 7 μ Μ。阶段6培养基中的碳源 可与阶段1培养基中相同。优选实施方案中，碳源是大约2%至大约5%，优选大约2%至大 约3 %，更优选大约3 %的蔗糖。—个实施方案中，增殖茎叶芽在阶段6培养基中培养大约1-3周，优选大约2周。 一个实施方案中，阶段6培养保持在前面所述的大约25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期， 55%至60%的相对湿度。阶段6培养基中的生长素IAA在1周内诱导生根。在没有生长调节剂或者仅仅包含分裂素的培养基中没有根形成。根的诱导必须有生长素，没有生长素就 没有根形成。在阶段6培养基中，平均每个茎叶会产生3cm长的10-15条根。生根后的小 植株成功炼苗，100%存活，移植到温室继续生长。另外，本发明提供了可用于高粱植株转化的系统，从而可获得高频转基因植株。这 种转化/转染方法对于高粱植物的转化并不是关键的；目前可获得多种转化或转染方法。 当获得转化作物或其它寄主细胞的更新的方法，可以直接采用这些方法。相应地，研制出许 多种将DNA序列插入寄主细胞基因组以得到序列转录和/或翻译，从而实现生物体表型改 变的方法。因而，可采用任何有效转化/转染的方法。例如参见Mathews等(1992)，Neuhaus 等(1987)，Wilde等(1992)，美国专利号7241937，7273966和7291765和美国专利申请公 开号2007/0231905和2008/0010704。还参见国际公开申请号W02005/103271。一个实施方案中，可采用本领域公知技术将外植体组织与农杆菌共同培养，所述 农杆菌菌株包含一个或多个DNA构建体，该DNA构建体包含一个或多个基因或核酸。可使 用本领域公知的常规技术选择转化组织。在一实施方案中，使用常规技术如粒子轰击技术 将DNA导入外植体组织。可使用本领域公知常规技术选择转化组织。转化或转基因植物可 使用在此描述的方法再生。同样，插入高粱植物的DNA(所述DNA)对于转化过程并不是关键性的。通常导入 植物的DNA是构建体的一部分。DNA可以是关注的基因，例如蛋白质编码序列，或者它可以 是能调控基因表达的序列，例如反义序列、正义抑制序列或miRNA序列。构建体通常包括有 效地连接所述DNA5’端和/或DNA3’端的调控区。包括全部这些元件的盒此处也称为表达 盒。表达盒另外可包括在表达盒构建体中的5’端前导序列。调控区(即启动子、转录调节 区和翻译终止区)和/或编码信号锚定的多聚核苷酸相对于寄主细胞或者相对于彼此可以 是天然的/类似的。可选地，调控区和/或编码信号锚定的多聚核苷酸相对于寄主细胞或者 相对于彼此可以是异源的。参见美国专利号7205453和美国专利申请
发明者K·纳丁穆图, R·A·瓦苏德万, S·拉马钱德兰 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司