专利名称：模拟老年痴呆病变的非人灵长类动物模型的建立方法
技术领域：
本发明属生命科学技术领域，具体涉及一种老年痴呆病变动物模型的建立方法
背景技术：
老年痴呆(AD)模型的最突出的病理变化是基底前脑胆碱能细胞的大量丧失和胆 碱能神经功能下降。胆碱能系统损伤模型研究主要着眼于模拟AD的认知缺损和前脑胆 碱能系统广泛的功能损害。1976年Peter Davies发现痴呆病人的临床症状和脑内的特 殊胆碱能的缺失存在某种关联，他开启了现代神经化学之门，因此是具有里程碑的意义的 (Davies and Maloney， 1976)。人们早就观察到，老年痴呆患者脑组织中乙酰胆碱(Ach)数 量减少，皮层胆碱乙酰化酶(CHAT)和乙酰胆碱酯酶(AchE)活性都降低。目前普遍认为胆 碱能神经元损伤和功能不全在老年性痴呆形成过程中有非常重要的作用。目前啮齿类模型 主要有以下几种 慢病毒致模。造模方法选用老年仓鼠(hamster)，应用慢病毒以微量稀释混悬液 经立体定位仪接种于脑特定部位，如黑质、纹状体等，破坏胆碱能细胞。缺点可恢复，不是 永久的损伤。 —侧海马伞切断致老年痴呆动物模型。造模机制海马伞切断造成胆碱能神经能 通路的受损，产生类似于造成老年痴呆的胆碱能神经细胞的大量丧失、记忆障碍，胆碱能神 经功能下降的效果。缺点本实验模型虽然很常用，也有效模拟了其病理特点，但是和自然 状态下的特征还是有区别的，对动物造成了一定的物理损伤，而且切断的部位很难把握，有 可能造成其它部位的神经细胞也造成伤害，对实验者的技术有相当高的要求，目前已基本 不采用。 除了以上几种模型外，还有兴奋性氨基酸引起的老年痴呆模型、利用特定免疫毒 素选择性地破坏基底前脑的胆碱能细胞，如192-IgG-S即orin。 1989年Kudo等通过注射基 底前脑与NGF相结合的白喉毒素来制造AD模型，通过NGF介导白喉毒素被带入胆碱能细 胞，从而达到破坏胆碱能细胞的作用。 以tau蛋白的过度磷酸化为特征的AD动物模型。有关神经元细胞骨架蛋白发生 过磷酸化的机制十分复杂，目前催化蛋白磷酸化反应的蛋白激酶(GSK23，CDK5和MAPK等) 与催化去磷酸化反应的磷酸酯酶(PP1，PP2A，PP2B等)的相对活性失衡，被认为是造成骨架 蛋白磷酸化的主要原因(Chun Lai Nieet al. ， 2007)。因此，蛋白激酶激动剂和抑制剂都可 以诱导tau蛋白异常、过度磷酸化，从而形成神经纤维纠结，进而诱发老年痴呆的形成。
冈田酸(0kadaic acid， 0A)损伤模型。0A选择性地抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷 酸酯酶1A和2A的活性，并提高蛋白激酶PKC的活性，引起tau蛋白异常磷酸化，从而形成 神经纤维纠结和老年斑的形成。优点该模型能够复制出AD的两大病理改变tau过度磷 酸化引起的神经纤维纠结，和老年斑，因此具有明显的优势。 除了上述模型以外，还有腹腔注射AlCl3，引起AI3的聚集和tau蛋白的折叠。除 了铝与AD的发生有关外，最新研究发现锌、铜、铁也可能与AD相关，并认为A13的沉积和氧
3化还原反应还受到铜、铁、锌的调节(Price et al. ， 1991)。缺点本模型采用的方式多是腹 腔注射铝溶液，费时比较长，小鼠要用六个月的时间，制作麻烦，不能反应年龄依赖性的A13 沉积的老年斑形成，胆碱能系统也是正常的。 与AP有关的AD动物模型。灌注模型(P-淀粉样肽损伤模型)1991 年Kowall等发现成年大鼠皮层的AP沉积可以引起神经元及其轴突相应的病理改变， Richard也证实了 A13 1_40对鼠胚胎海马神经元具有毒性作用，因此A P灌注理论可以作为 制备AD模型的理论基础，据目前的研究发现，老年动物对AI3反应更敏感。这种模型也有 许多缺点(l)该模型需要注射AI3 ，注射本身会对脑组织形成穿透性损伤，注射次数越多 损伤越大；(2)要使大量的AP弥散性地分布到脑内集仍有许多问题，用适当的载体有助于 的扩散(Mckee AC et al. ， 1998)。而且造模效果受多种因素的影响，如淀粉样肽的纯 度、组成，载体的类型和成份，注射位点的选择，动物的个体差异等。 衰老认知障碍动物模型。基于衰老，人们提出各种学说，比如氧化自由基增多和线粒 体破坏，从而引起细胞的大量凋亡，包括神经细胞。衰老认知障碍动物模型就是通过各种人工 或者自然的衰老方式制成老年痴呆模型。目前用老鼠做成的模型有乳糖损害模型。长期注射 D-半乳糖后所引起的多系统功能衰退等均与老龄动物相似，但是该法需时间较长且没有老年 斑的形成。此外还有快速老化鼠，最先由竹田俊男通过对AKR/j自然变异小鼠进行近交延代培 养得到一种自然快速老化小鼠(聂伟等，2000)。它具备和AD相似的病理表现:AI3沉积，相关 的递质和酶活性改变，神经营养因子mRNA表达明显下降，脑内与氧化应激相关的酶活性改变， 线粒体功能改变，脑内葡萄糖代谢障碍，免疫功能异常等(Shang YZ et al. ，2001)。
转基因技术制作的AD模型。目前转基因动物已经取得卓有成效的进展，与AD相 关的基因APP基因、早老素PSl及PS2基因、ApoE基因相关的基因突变、基因缺陷、转基因的 AD鼠均已建成。根据成本、繁殖力等原因目前选用较多的实验动物是小鼠。常用的转基因 动物模型的制作程序如下引物的设计和靶基因的制备；质粒的构建；超排卵和取卵与重 组基因注入受精卵；植入假孕受体；模型的检测与评价。目前制成的转基因AD模型有与 PS1基因有关的AD模型。a. hPSl (L286V，H163R)表达人类PS1基因伴有L286V或者H163R 突变的，细胞内有AI3 42沉淀，随着年龄的增长会出现神经系统功能退化(Chui et al.， 1999)。 b.hPSl(I123T)表达特定位点插入的PSl基因，伴有I213T突变，有A P 42的积累。 (Nakano et al. ， 1999)等。除此之外，与ApoE及tau蛋白基因相关的AD小鼠模型都已建 成。三转基因鼠3XTg-AD同时表达PSl(M146V)，APPsw和tau(P301L)，在tau蛋白异常磷 酸化或者装配前就有AP样沉淀形成，突触功能消失，完全致病前认知功能降低。(Oddo et al. ，2003)转基因动物的优点是转基因动物模型可以在活体上研究某一特定致病基因的 作用，是研究AD的独特而重要的模型。缺点是绝大多数转基因动物模型能够复制出类似 AD病人脑内的部分病理变化，其中只有少数模型观察到了学习记忆功能障碍，但距离AD尚 有一定差距，结果还不能令人满意。但也有人报道，在转基因鼠中观察到了全部或部分的AD 的组织学的特征，如老年斑、神经元纤维缠结和神经元退化等，取得了令人鼓舞的结果。目 前的转基因模型大部分是移植了一个APP、PSl、PS2或tau蛋白等基因，与真正的由一组基 因控制的动物模型还有较大差距。目前的转基因动物AD模型仅是部分取得成功，由于外源 基因的植入有可能影响一些基因的表达和调控，扰乱机体的内环境，出现一系列抗病能力 差，繁殖力差等的特征。又因其价格昂贵，难以批量生产等原因，短期内仍难以推广使用。
非人灵长类动物在亲缘关系上和人最接近，在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，是极其珍贵的实验动物，其应用价值远超过其他种属的实验动物。无论是
自发模型还是诱发模型，非人灵长类动物模型较啮齿类能更好地模拟其病理变化，神经生物学特性与人类非常相似，而且最重要的是，根据设计，非人灵长类经过训练，可用于完成特定的与记忆有关的任务，用于评价认知能力、情绪行为等的变化，这也是啮齿类动物无法替代的，因而是研究该病的最理想的动物模型。非人灵长类动物对筛选治疗老年痴呆的药物也起着至关重要的作用。 因为甲醛是内源性的，而我们日常生活中也经常接触到甲醛，因此有人提出老年痴呆可能与甲醛有关，最近赫荣桥等的研究显示老年痴呆病人体内的甲醛水平要远远高于正常老年人的甲醛水平。甲醛是甲醇的代谢产物之一，许多研究已经表明甲醛通过加速神经元凋亡在神经元细胞中诱导了类似淀粉样蛋白的微管束相关蛋白tau蛋白的聚集和折叠。tau蛋白是神经纤维缠结的主要成分。神经纤维缠结是老年性痴呆症的主要病理现象。低浓度的甲醛会引起tau的聚集，加拿大的试验小组也证明低浓度甲醛会促进AI3聚集，随着对AD病因和发病机制研究的深入和相关知识的积累，灵长类AD动物模型将来会得到广泛应用，对能够筛选得到具有良好开发前景的AD治疗药物及探索出治疗AD更加有效的方法做出重要贡献。 现有的关于甲醛与老年性痴呆症相关联的研究都是在机理方面，还没有建立相关的老年性痴呆动物模型的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种模拟老年痴呆病变的非人灵长类动物模型的建立方法，该模型采用活体动物和甲醇来制作。 由于直接口服甲醛造成的伤害太大，容易造成实验动物的死亡，所以选择甲醇代替甲醛，甲醇在体内经过乙醇脱氢酶的作用下可以生成甲醛。
本发明方法按以下步骤进行 让没有表现出老年痴呆病变症状的非人灵长类动物禁水，将体积百分比浓度为0. 5% 3%的甲醇水溶液、或该甲醇水溶液还溶有能让动物产生喜好感的调味剂，让动物连续自然饮用14天 365天，控制每天动物的甲醇摄入量为0. 5mg/kg 2mg/kg，得到老年痴呆病变的非人灵长类动物模型。 所说非人灵长类动物优选恒河猴，最好是雄性恒河猴。让动物产生喜好感的调味剂最好是糖。 本发明的积极效果按发明方法建立了活体非人灵长类动物模型。本发明提供的动物模型对研究该病和筛选治疗老年痴呆的药物可起重要作用。
附图为实施例1中给药前和给药后恒河猴空间延迟任务成绩的差异对比。
具体实施方式
实施例l。
材料选取4-8岁青年雄性恒河猴7只，体重3kg-llkg。其中4只健康猴用来做 行为实验；3只残疾猴用来试药以确定甲醇的最大摄入量，避免健康猴超剂量死亡，降低实 验成本。甲醇为天津富宇精细化工有限公司生产。 方法首先给动物禁水，每日将纯的甲醇溶于水让动物自己口服，如果猴子不喝可 适当放少许白砂糖。据李来玉等关于甲醇在恒河猴体内的代谢极其与毒性的关系一文报 道，恒河猴72小时内三次给药总剂量为9ml/kg致死率为100% (李来玉等，1991)，因此 每天按照0. 5-2ml/kg的剂量按照从高到低稀释到清水中依次试药，每个剂量一个月，观察 其行为变化，用时半年(2ml/kg已喂三个月)，结果表明每天O. 5ml/kg， lml/kg， 1. 5ml/kg， 2ml/kg动物饮食均正常，且均未出现动物死亡。随后给4只健康猴做行为测试，测定空间延 迟成绩，给药前和给药后做对照，给药剂量按照每天lml/kg上升到1. 5ml/kg，最后上升到 2ml/kg。 实验结果实验室给特定剂量的甲醇制作恒河猴老年痴呆模型，其给药前、后空间 延迟任务成绩已出现明显的差异。 附图给出了给药前和给药后(1. 5ml/kg)恒河猴空间延迟任务成绩的差异情况。 柱状图代表两只恒河猴的平均正确次数(每次试验分30个trial,)，喂药前的成绩为白 色的柱状图，口服给药后的成绩为黑色的柱状图。甲醇处理过的恒河猴因为空间学习和记 忆受到了损伤，正确率与给药前相比有极显著差异。数据以总的平均值±方差表示，**P < 0. 01表示恒河猴在给药前后空间记忆能力与给药前相比有极显著差异。
实施例2。取没有表现出老年痴呆病变症状的4 15岁的食蟹猴共10只，体重 3kg 15kg。甲醇为天津富宇精细化工有限公司生产。 让给药动物禁水，使其能连续自然饮用体积百分比浓度为2%的甲醇水溶液30 天，控制每天动物的甲醇摄入量为1. 5mg/kg。对给药前和给药后的同一只猴做行为测试，测 定空间延迟成绩做对照。 结果给药猴老年痴呆模型与给药前相比，空间延迟任务成绩出现明显的差异。
实施3。取没有表现出老年痴呆病变症状的4 15岁的短尾猴共10只，体重3kg 7kg。甲醇为天津富宇精细化工有限公司生产。 让给药动物禁水，使其能连续自然饮用体积百分比浓度为3%的甲醇水溶液20 天，控制每天动物的甲醇摄入量为2mg/kg。对给药前和给药后的同一只猴做行为测试，测定 空间延迟成绩做对照。 结果给药猴老年痴呆模型与给药前相比，空间延迟任务成绩出现明显的差异。
权利要求
模拟老年痴呆病变的非人灵长类动物模型的建立方法，其特征在于按以下步骤进行让没有表现出老年痴呆病变症状的非人灵长类动物禁水，将体积百分比浓度为0.5％～3％的甲醇水溶液、或该甲醇水溶液还溶有能让动物产生喜好感的调味剂，让动物连续自然饮用14天～365天，控制每天动物的甲醇摄入量为0.5mg/kg～2mg/kg，得到老年痴呆病变的非人灵长类动物模型。
2. 如权利要求1所说的方法，其特征在于非人灵长类动物为恒河猴。
3. 如权利要求2所说的方法，其特征在于恒河猴为雄性。
4. 如权利要求1所说的方法，其特征在于让动物产生喜好感的调味剂为糖。
全文摘要
模拟老年痴呆病变的非人灵长类动物模型的建立方法属生命科学技术领域。现有的关于甲醛与老年性痴呆症相关联的研究都是在机理方面，还没有建立相关的老年性痴呆动物模型的方法。本方法按以下步骤进行让没有表现出老年痴呆病变症状的非人灵长类动物禁水，将体积百分比浓度为0.5％～3％的甲醇水溶液、或该甲醇水溶液还溶有能让动物产生喜好感的调味剂，让动物连续自然饮用14天～365天，控制每天动物的甲醇摄入量为0.5mg/kg～2mg/kg，得到老年痴呆病变的非人灵长类动物模型。本发明提供的动物模型对研究该病和筛选治疗老年痴呆的药物可起重要作用。
文档编号A01K67/027GK101755709SQ20101003918
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者李燕皎, 杨美凤, 胡新天, 马原野 申请人:中国科学院昆明动物研究所;昆明亚灵生物科技有限公司