专利名称：一株虫生广布拟盘多毛孢菌株gxstyj03及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术防治领域，具体涉及一株虫生广布拟盘多毛孢真菌 (Pestalotia disseminata (Thuem.) Stey.)的新菌株GXSTYJ03和通过培养它制备成菌液 的方法以及菌液在松突圆蚧防治上的应用。
背景技术：
已知的拟盘多毛孢真菌(Pestalotia)均分离自植物体，或为植物病原真菌，或为 植物内生真菌。长期以来人们一直把拟盘多毛孢真菌当作植物病原菌进行研究，直到20世 纪90年代才开始有内生拟盘多毛孢的报道。而本发明分离自松突圆蚧僵虫体的广布拟盘 多毛孢真菌菌株(GXSTYJ03)应属虫生真菌，关于虫生拟盘多毛孢真菌的研究和应用至今 仍无报道。松突圆蚧Hemiberlesia pitysophila Takagi，又名松栉盾蚧，隶属同翅目 Homoptera蚧总科Cocoidea盾蚧科Diaspididae灰圆盾蚧亚科Diaspidinae突圆蚧属 Hemiberlesia。主要危害松属植物，在我国松突圆蚧的发生区，目前主要危害马尾松、湿地 松和加勒比松。至今，不仅最早发生危害的广东全境的松树受其危害，损失惨重，近年来又 在福建、广西、江西等地迅速扩散蔓延，从幼树至二三十年生的大树均可受害，造成大面积 的松林枯死，防控形势非常严峻，是我国对内对外的有害生物检疫的害虫。目前，控制松突圆蚧危害的主要措施有综合营林措施和天敌小蜂寄生。各种天敌 小蜂在松突圆蚧上的寄生率不同，最高可达30%。大面积放养小蜂对控制松突圆蚧的虫口 密度有一定的作用，但由于种源有限，繁育成本高，其应用受到严重制约。探索微生物防治技术也取得一些可喜的进展。用寄生在甘蔗粉蚧上的寄生曲霉菌 对松突圆蚧进行致病力试验，其寄生率为13. 9% 64.9%。采用板栗红蚧上分离的芽枝状 枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)菌粉对3467头松突圆蚧毒力测定，平均死亡率 达38. 9% ；林间试验效果达20.0%以上，最高达57.7%。然而，该两种微生物防治技术的 研究都未能进入开发应用阶段。上述防控措施，均存在防控效果不理想或防控寄生率低的不足。因此，必须针对松 突圆蚧的生物学特点，研制出有效防治和控制松突圆蚧的应用技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03以及该菌株的液 体培养物制备方法和用途。该菌株的液体培养物制剂能够有效防治和控制松突圆蚧。本发明人经过广泛的调查研究，从松突圆蚧典型僵虫体上分离、筛选，获得一株广 布拟盘多毛孢真菌(Pestalotia disseminata (Thuem.) Stey.)菌株GXSTYJ03。基于提供防 治松突圆蚧微生物菌株的目的，作了进一步的研究，该菌株能够有效致死松突圆蚧，并可通 过制备该菌株的液体培养物来实现。一株松突圆蚧虫生真菌菌株GXSTYJ03，该菌株是从松突圆蚧僵虫体中分离、筛选出来的广布拟盘多毛孢菌株系(学名:Pestalotia disseminata (Thuem. ) Stey.)，所述菌 株含有GXSTYJ03 ITS rDNA序列SEQ ID NO. 03，于2010年7月16日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC3990。一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03在制备防治松突圆蚧的制剂中的应用。所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03在制备防治松突圆蚧的制剂中的应 用，是将所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培养物直接喷施于染虫的树 冠上或稀释3-5倍后施用或均浆后稀释3-5倍施用。一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培养物在防治湿地松粉蚧的制剂 中的应用。所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培养物的培养方法，采用下 列液体培养基中的一种按所述培养条件制备A培养基去皮马玲薯200mg切碎煮30min，取过滤液，蔗糖10g，自来水IOOOml ；B 培养基麸皮 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ；C 培养基花生饼粉 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ；D培养基花生饼粉40g,麸皮IOg,蔗糖10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ；E 培养基面粉 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ；培养条件是在需氧条件下在26_30°C和pH 6. 5-7. 0下进行，培养时间3_5d。根据本发明，一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03可以从典型的松突圆蚧僵 虫体上分离出来。本发明的一株虫生广布拟盘多毛孢真菌菌株GXSTYJ03于2010年7月16日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC3990。本发明所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03具有以下微生物学特征1.形态学特征在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，菌丝有隔，分枝；分生孢子团黑 色，直径75-150 μ m，有的可以达到250 μ m。分生孢子盘暗色，圆盘形或垫形，近表生；分生 孢子梗短，简单；分生孢子被四个真隔分为五个细胞，呈椭圆形到纺锤形，渐狭到基部，通常 是19-25 X 6-8 μ m。中间3个细胞深色，呈橄榄绿色，着色平均或者靠近上部的2个细胞稍 暗，大约13_17μπι;两端突出的细胞透明无色，顶端细胞锥形到圆筒形，基底细胞稍宽。顶 生3根鞭毛附属丝，偶有2根，很少有4根，大约8-20 μ m ；基部生0_1根附属物，3-7 μ m。2.培养学特征本发明的菌株是一种需氧菌，在26_28°C显示出最佳的生长能力。当在28°C在以 下各种固体培养基中培养96h时，本发明的菌株具有以下特性1)在A培养基中培养时，菌落白色，稍扁平，中间部分微红色，绒状，质地松软，边 缘菌丝稀疏整齐，菌落直径4. Ocm0背面颜色呈淡黄色且分为几个同心环。2)在B培养基中培养时，菌落白色，稍扁平，中间部分微红色，绒状，质地松软，边 缘菌丝稀疏整齐，菌落直径2. 7cm。背面颜色呈黄色，有同心环。3)在C培养基中培养时，菌落白色——粉红色，稍凸起，绒状，质地松软，边缘菌丝 较密整齐，菌落直径3. 8cm。背面颜色呈深黄色，有同心环。
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4)在D培养基中培养时，菌落白色，稍扁平，中间部分微红色，绒状，质地松软，边 缘菌丝较密整齐，菌落直径3. 4cm。背面颜色呈黄色，有同心环。5)在E培养基中培养时，菌落白色——粉红色，凸起，绒状，质地松软，菌丝发达而 密集整齐，菌落直径4. 3cm。以上固体培养基中，A、B、C、D培养基的凝固剂为琼脂20g/L，E培养基的凝固剂为 适量面粉。本发明的突出优点在于1.由于能将菌株的液体培养物直接用于防治松突圆蚧，其菌液生产所需设备和设 施相对简单，生产工艺大大简化，菌液生产的时间短，显著地降低生产成本。2.使用本菌株的液体培养物防治松突圆蚧，与粉剂相比，可明显增强菌剂的粘附 力，且有利于菌体的存活和对蚧虫体的侵染。3.经多次林间防治试验证明，本发明菌株制备的液体制剂能够有效地防治松突 圆蚧，与本菌株的粉剂比较，其林区防治平均死虫率可达99.7%，比粉剂的防治死虫率 95. 7%以上提高4个百分点左右。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅是说明性的，本发明 并不受这些实施例的限制。实施例11、制备菌株液体培养物将一支斜面菌种接种到盛有300ml液体C培养基的500ml三角烧瓶中，共接种20 瓶。在旋转式震荡摇床上以每分钟180转的速度在28°C条件下培养72小时，即得本菌株液 体培养物。2、防治松突圆蚧试验用5倍清水稀释该菌液，充分摇勻后，用粗纱布稍做过滤，将菌液中的粗颗粒物去 除。在松突圆蚧重灾成熟林区中设置试验区组，喷雾于染虫的马尾松树冠上，让菌液自然感 染虫体，并分别用本菌株的粉剂和清水为对照。1月后调查防治结果于表1。表1本菌株液体培养物对松突圆蚧的防治结果
36. 10实施例21、制备菌株液体培养物将一支斜面菌种接种到盛有300ml液体A培养基的500ml三角烧瓶中，共接种15 瓶。在旋转式震荡摇床上以每分钟180转的速度在28°C条件下培养72小时，即得本菌株液 体培养物。
2、防治松突圆蚧试验用5倍清水稀释该菌液，充分摇勻后，分别在三片松突圆蚧重灾中龄林区中设置 试验区组，喷雾于染虫的马尾松树冠上，让菌液自然感染虫体。1月后调查防治结果于表2。表2本菌株液体培养物对松突圆蚧的防治结果 实施例31、制备菌株液体培养物将一支斜面菌种接种到盛有300ml液体C培养基的500ml三角烧瓶中，共接种12 瓶。在旋转式震荡摇床上以每分钟180转的速度在28°C条件下培养96小时，即得本菌株液 体培养物。2、防治松突圆蚧试验用3倍清水稀释该菌液，充分摇勻后，在松突圆蚧重灾幼龄林区中设置试验区组， 喷雾于染虫的马尾松树冠上，让菌液自然感染虫体。1月后调查防治结果于表3。表3本菌株液体培养物对松突圆蚧的防治结果
权利要求
一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03，其特征在于，该菌株于2010年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC 3990。
2.一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03在制备防治松突圆蚧的制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03在制备防治松突圆蚧 的制剂中的应用，其特征在于是将所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培 养物直接喷施于染虫的树冠上或稀释3-5倍后施用或均浆后稀释3-5倍施用。
4.一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培养物在防治湿地松粉蚧的制剂中 的应用。
5.所述一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03的液体培养物的培养方法，其特征在 于，采用下列液体培养基中的一种按所述培养条件制备A培养基去皮马玲薯200mg切碎煮30min，取过滤液，蔗糖10g，自来水IOOOml ； B 培养基麸皮 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ； C 培养基花生饼粉 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ； D培养基花生饼粉40g，麸皮10g，蔗糖10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水1000ml ； E 培养基面粉 50g，蔗糖 10g, KH2PO4O. 5g，MgSO4O. 2g，自来水 1000ml ； 培养条件是在需氧条件下在26-30°C和pH 6. 5-7. 0下进行，培养时间3_5d。
全文摘要
一株虫生广布拟盘多毛孢菌株GXSTYJ03，该菌株于2010年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3990。该菌株是分离自松突圆蚧僵虫体内而不是分离自植物体内。通过培养它制备成菌液，能够有效地杀死松突圆蚧各种虫态，可用于开发松突圆蚧生防菌。
文档编号A01P7/04GK101892165SQ20101024007
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者乔梦吉, 吕成群, 方丽英, 韦继光, 黄宝灵 申请人:广西大学