专利名称：一种百合脱毒籽球的快速培养方法
技术领域：
本发明公开了切花百合脱毒培养的组培方法和利用鼓泡式生物反应器快速膨大脱毒小鳞茎(种球)的培养方法，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程的技术领域。
背景技术：
百合是重要的观赏花卉，主要用于切花品种生产。百合在开放条件下生长，不可避免地被病毒侵染，百合无症病毒Lily symptomless virus (LSV)、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus (CMV)、百合斑驳病毒 Lily mottle virus (LMoV)、郁金香碎花病毒 Tulip breaking virus (TBV)和百合丛簇病毒Lily rosettle virus (LRV)是影响百合花卉生产的常见病毒。病毒侵染植株会造成百合农艺性状严重退化，极大地影响了百合的生产。寄生在百合鳞茎中的病毒，随着鳞茎芽眼萌发长成植株的生长过程，病毒会在百合植株体内进行复制繁殖，但在代谢活跃的茎尖分生组织中没有病毒。百合脱毒技术就是利用茎尖部分没有病毒的特性，在无菌环境条件下，利用人工配置的培养基，培育出无病毒试管苗或籽球，然后将组培苗和籽球在人工隔离或天然隔离条件下，生长成为供切花使用的商品种球。 近年来国内百合的消费量逐年增大，但目前我国百合生产中，将近90%以上的种球依赖进口。少量的国产脱毒种球的生产，绝大多数采用传统组培方式，不但生产周期长，而且还需要投入大量的人力，频繁的更换培养基，生产过程需要很大的培养空间，为了保证培养空间温湿度，满足培养条件需要消耗很多能源。为了解决国产脱毒种球生产中存在的问题，特开展利用生物反应器快速培养百合脱毒籽球方法的研究。
发明内容
本发明包括外植体灭菌和生长点的剥取；脱毒培养；组培各阶段培养基的配比； 脱毒籽球在反应器中的膨大培养；冷藏春化；驯化移栽几个过程。本发明选用花卉市场大众喜爱的“西伯利亚”(Siberia)、“索帮”(Sorborme)、“马可波罗”(Marco polo)、“曼妮莎” (Manissa)、“康伽德奥” (Concad' 0) 5个品种为材料，采用综合脱毒技术，即将热处理、 抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法。优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序， 快速培养得到脱毒组培籽球，缩短了百合脱毒优质种球的快繁时间，同时籽球的定植成活率较高。本发明易于在切花百合原种的规模化快繁生产中推广应用。本发明通过以下技术方案实现利用生物反应器快速培养百合脱毒种球的方法，按如下步骤进行(1)百合种球的栽种在35-38°C条件下种植百合种球，栽种后经7_15天的培养， 待芽长高叶集生茎的中部形似莲座状(2)外植体灭菌和生长点的剥取采集步骤(1)的百合茎尖，用中性肥皂水清洗 3-5分钟，自来水冲洗过夜，0. 升汞灭菌5-10分钟，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为
40. 4-0. 8 (mm)，将剥取的生长 点作为组培培养外植体。(3)脱毒培养将步骤(3)剥取的外植体百合茎尖生长点接种到诱导培养基 (1/2MS+6-BA 1. 0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 琼脂粉 6g/L (pH 5. 8))，经过 40-60 天培养，生长点膨大成直径2-3cm的叶丛。②将叶丛切成0. 5cm小块，接种于含病毒唑的培养基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-lOmg/L+ 琼脂粉 5g/L+0. 5%活性炭(pH5. 8))，经过40-60天培养，形成带球的瓶苗。(4)病毒检测将步骤②瓶苗进行酶联免疫吸附测定实验(ELISA)和RT-PCR检测，确认无百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)病毒。(5)脱毒籽球诱导培养将步骤②经过病毒检测无病毒脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 琼脂粉 5g/L+0. 5% 活性炭(pH 5.8)), 在温度22士 1°C，光照强度1500Lx，光照12h/d的环境条件下培养40_60d，直接诱导出脱毒籽球。(6)增殖培养将步骤(4)组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3-4块直径0. 3-0. 5cm材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度22士 1°C，光照12h/ d，光照强度1000-1500LX的环境条件下培养2个月，可以扩繁3_4倍。(7)脱毒籽球的膨大培养将步骤(5)培养的组培籽球分开，形成单个的小籽球， 大约直径0. 3-0. 5cm，接种于籽球膨大培养基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆CPPU l_4mg/ L+6%蔗糖(pH 5.8))，在22士11、15001^ 12h光照、12h黑暗条件下培养45天，培养籽球直径可达1. 0-1. 4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0. 7-1. 2g/粒。(8)冷藏取出步骤(6)培养的脱毒籽球，用清水冲洗掉培养液，包裹于消毒草炭中，经3-4°C冷藏处理30-40天打破休眠。(9)移栽驯化将步骤(7)籽球取出，用2000倍阿米西达药液浸泡籽球20分钟， 然后定植到80-90穴的穴盘中，穴盘基质草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻装盘。定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘。放到网室内养护，昼温20-25°C，夜温10-15°C，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次1/2MS营养液。(10)待籽球直径长到2cm以上，可选择具夏季冷凉气候的800 1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
权利要求
1.利用生物反应器快速培养百合脱毒种球的方法，按如下步骤进行(1)外植体灭菌和生长点的剥取在35-38°C条件下种植百合种球，经过7-15天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗3-5分钟，自来水冲洗过夜，0. 升汞灭菌5-10分钟，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0. 4-0. 8 (mm)，将剥取的生长点立即接种。(2)脱毒培养，步骤①诱导培养，剥取的百合茎尖生长点接种到诱导培养基 (1/2MS+6-BA 1. 0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 琼脂粉 6g/L (pH 5. 8))，经过 40-60 天培养，生长点膨大成直径2-3 (cm)的叶丛。②将叶丛切成0.5 (em)小块，接种于含病毒唑的培养基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5_10mg/L+ 琼脂粉 5g/ L+0. 5%活性炭(pH5. 8))，经过40-60天培养，形成带球的瓶苗。(3)病毒检测将步骤②瓶苗送到，农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明)，经检测确认无任何病虫害现象并不带百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)等病毒，才确认是百合脱毒种苗。(4)脱毒籽球诱导培养经过病毒检测，将步骤②脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基 (MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 琼脂粉 5g/L+0. 5% 活性炭(pH 5.8)),在温度 22士 1°C，光照强度1500Lx，光照12h/d的环境条件下培养40_60d，直接诱导出脱毒籽球。(5)增殖培养将步骤(4)组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3-4块直径 0. 3-0. 5cm材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度22士 1°C，光照12h/d，光照强度1000-1500LX的环境条件下培养2个月，可以扩繁3_4倍。(6)脱毒籽球在生物反应器内液体培养将步骤( 培养的组培籽球分开，形成单个的小籽球，大约直径0. 3-0. 5cm，然后接种于反应器内。液体培养基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆CPPU Hmg/L+6%蔗糖(pH 5. 8))，在22士 l°C、1500Lx和2L/min通气量条件下培养 45天，培养籽球直径可达1. 0-1. 4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0. 7-1. 2g/粒。(7)冷藏取出步骤(6)培养的脱毒籽球，用清水冲洗掉培养液，包裹于消毒草炭中，经 3-4°C冷藏处理30-40天打破休眠。(8)移栽驯化将步骤(7)籽球取出，用2000倍阿米西达药液浸泡籽球20分钟，然后定植到80-90穴的穴签中，穴盘基质草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻装盘。定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘。放到网室内养护，昼温20-25°C，夜温10-15°C，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次1/2MS营养液。(9)待籽球直径长到2cm以上，可选择具夏季冷凉气候的800 1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
2.根据权利要求1所述的方法，其特点在于采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特点在于培养材料为“西伯利亚”(Siberia)、“索帮”(Sorbonne)、“马可波罗”(Marco polo)、“曼妮莎”(Manissa)、“康伽德奥”(Concad' 0)5 个品种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特点在于在35-38°C条件下种植百合种球，经过7-15天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗3-5分钟，自来水冲洗过夜，0. 升汞灭菌5-10分钟，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0. 4-0. 8 (mm)， 将剥取的生长点立即接种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特点在于优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序。诱导培养基(1/2MS+6-BA 1.0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 琼脂粉 6g/L)； 脱毒培养基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-lOmg/L+琼脂粉 5g/L+0.5% 活性炭)；籽球诱导和增殖培养基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4 %蔗糖+琼脂粉5g/ L+0.5%活性炭)；液体培养基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆 CPPU l_4mg/L+6%蔗糖)； 培养程序脱毒培养一病毒检测一籽球诱导及增殖培养一生物反应器内液体培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特点在于所述籽球膨大液体培养，采用鼓泡式可控光温生物反应器，反应器运行环境为22士 l°C、1500Lx和2L/min通气量。
7.根据权利要求1所述的方法，其特点在于移栽驯化，用穴盘定植，草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻装盘。定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘。放到网室内养护，昼温 20-250C，夜温10-15°C，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次1/2MS营养液。
全文摘要
本发明公开了百合籽球生产的综合脱毒技术，即通过在35-38℃条件热处理栽种百合种球7-15天、剥取热处理后百合种球茎尖生长点为外植体，接种于病毒唑(Ribavirin)含量5-10mg/L的培养基中脱毒培养，用酶联免疫吸附测定实验(ELISA)和RT-PCR检测对脱毒组培苗进行百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)病毒病毒的检测，此发明通过综合脱毒技术确保培养出的百合籽球去除病毒感染，并优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序，快速培养得到脱毒组培籽球，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程领域技术。
文档编号A01H4/00GK102440185SQ20101050628
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者安利清, 徐佳, 杨凯, 王春城, 王树栋, 赵祥云 申请人:王春城, 王树栋, 赵祥云